《Bioorganic Chemistry》：Structure-guided identification and functional evaluation of small-molecule candidates predicted to target the LAG-3/MHC-II interface
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•结构指导筛选390万种化合物鉴定出Z21和Z28。•Z28增加了活化PBMCs中产生IFN-γ的CD4+
和CD8+
T细胞。•Z21和Z28与抗PD-1联合使用时减少了MC38肿瘤生长。•两种化合物都增加了肿瘤浸润的CD8+
T细胞。•Z21和Z28减少了肿瘤浸润的CD8
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结构指导筛选390万种化合物鉴定出Z21和Z28。
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Z28增加了活化PBMCs中产生IFN-γ的CD4+和CD8+T细胞。
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Z21和Z28与抗PD-1联合使用时减少了MC38肿瘤生长。
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两种化合物都增加了肿瘤浸润的CD8+T细胞。
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Z21和Z28减少了肿瘤浸润的CD8+LAG-3+T细胞的频率。
引言
与主要直接作用于肿瘤细胞的传统治疗不同，癌症免疫治疗旨在增强宿主对肿瘤的免疫反应，并已在多种恶性肿瘤中显示出临床获益。其中，免疫检查点抑制剂（ICIs）通过阻断抑制T细胞活化和效应功能的负调控通路，在多种肿瘤类型中展现出显著临床疗效。靶向细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4）和程序性死亡蛋白1（PD-1）的抗体治疗已改善多种肿瘤类型患者的生存期，并成为现代癌症治疗的重要组成部分[1], [2], [3]。然而，只有部分患者能够从基于抗体的免疫检查点抑制剂中获得持续临床获益，原发性和获得性耐药仍然是限制其疗效的重要因素[4], [5], [6]。此外，基于抗体的ICIs仍存在一些药理学和临床应用限制，包括生产成本高、通常需要静脉给药、组织渗透能力有限、体内半衰期长导致全身暴露时间延长以及免疫相关不良事件风险增加[4], [5]。因此，开发新的免疫检查点靶点和探索抗体以外的治疗模式已成为提高免疫治疗疗效和可控性的重要方向。
淋巴细胞活化基因-3（LAG-3，CD223）是表达于活化T细胞、耗竭T细胞和调节性T细胞上的抑制性受体。其结构与CD4相关，并以比CD4更高的亲和力结合主要组织相容性复合体II类分子（MHC-II）[7], [8], [9]。LAG-3-MHC-II结合可限制T细胞增殖、细胞因子分泌和效应功能。在肿瘤微环境中，肿瘤浸润T细胞（TILs）上LAG-3的持续表达与T细胞功能受损相关，并可能有助于免疫逃逸，尤其是在伴有PD-1或TIGIT表达时[10]。LAG-3还识别其他配体，包括纤维蛋白原样蛋白1（FGL1）、半乳糖凝集素-3和LSECtin，这表明其免疫抑制活性不仅限于单一的配体-受体相互作用[11], [12], [13], [14]。
LAG-3的临床相关性已通过relatlimab（一种抗LAG-3单克隆抗体）联合nivolumab获批用于治疗晚期黑色素瘤患者得到证实[15], [16], [17]。该临床开发确立了LAG-3作为治疗相关的免疫检查点地位，并为双靶点PD-1/LAG-3阻断的价值提供了证据。然而，大多数正在开发的LAG-3靶向策略仍以抗体为基础。尽管抗体非常适合细胞外检查点阻断，但其大分子尺寸可能限制其渗透入实体瘤。其长半衰期还可能降低治疗相关毒性出现时的给药灵活性[18], [19]。因此，小分子可能提供一种替代方法来调节LAG-3，在化学优化、肿瘤可及性、制造和药代动力学控制方面具有潜在优势[20], [21], [22], [23]。然而，LAG-3导向的小分子发现仍远不如PD-1/PD-L1或CTLA-4发达。
LAG-3/MHC-II复合物的结构研究为基于结构的LAG-3导向化合物筛选提供了有用信息。这些结构定义了受体-配体界面的关键特征，并可指导计算分析中潜在结合区域的选择[24], [25], [26]。虚拟筛选、分子对接、分子动力学模拟和结合自由能分析可用于在实验测试前优先化化合物[27], [28], [29], [30], [31]。然而，这些预测本身不足以确认候选化合物与LAG-3的直接结合，也不能证明它们对LAG-3/MHC-II相互作用具有阻断作用。这一局限性在LAG-3相关研究中尤为显著，因为LAG-3的功能不仅取决于受体表达和配体可及性，还受免疫突触形成和肿瘤微环境等因素影响。因此，候选化合物应通过互补系统进行评估。短期人T细胞活化试验可提供功能活性的初步评估，而肿瘤荷模型则需要用于检查这种活性在更复杂的免疫微环境中是否得以保留。
在本研究中，我们建立了一个多阶段结构指导筛选流程，以鉴定靶向LAG-3/MHC-II相互作用区域附近预测结合口袋的小分子候选物。研究始于约390万种可购买的ZINC20化合物，随后经过AutoDock-GPU大规模对接筛选、Glide分层对接、理化性质和ADMET过滤、500 ns全原子分子动力学模拟，以及MM/PBSA结合自由能分析。这些步骤用于逐步筛选和优先化候选化合物。基于预测的结合构象、界面稳定性、结合能估计结果和类药特性，最终选择了Z21和Z28用于后续生物学评价。我们首先检查了它们对活化人外周血单个核细胞中IFN-γ产生的影响。考虑到这种短期体外激活系统不能完全模拟肿瘤相关免疫抑制状态，我们进一步在MC38同基因移植肿瘤模型中将候选化合物与抗PD-1治疗联合使用，并使用流式细胞术分析TILs的表型变化。本研究旨在鉴定并实验评估预测靶向LAG-3的小分子候选物。然而，候选化合物能否直接结合LAG-3以及能否阻断LAG-3/MHC-II相互作用仍需进一步研究。
章节片段
小分子库筛选
ZINC20数据库中的商业化合物作为初始筛选库使用。通过WGET工具从ZINC20交易版浏览器下载化合物，格式为SDF（*.sdf.gz），参数设置为3D、标准反应性、库存充足、参考/中性pH值、相似先导化合物子集，净电荷范围为-2到+2。约390万种独特小分子保留用于基于结构的筛选。
基于结构的候选LAG-3口袋鉴定
DoGSiteScorer在LAG-3上鉴定了九个潜在配体结合口袋（补充表S1）。其中，P_0具有最高的预测药物评分（0.86），以及最大的腔体体积（654.98 ?3）和最大深度（23.54 ?）。重要的是，P_0位于实验表征的LAG-3/MHC-II相互作用界面附近。G103–P111 Loop 2区域被认为参与MHC-II β2识别，而R121和R125有助于极性LAG-3/MHC-II α2界面。
讨论
在本研究中，我们建立了一个结构导向工作流程，用于筛选可能结合到LAG-3/MHC-II相互作用区域的小分子候选物。该筛选过程基于约390万种可购买化合物，整合了大规模对接、分层Glide优化、基于ADME的筛选、500 ns分子动力学（MD）模拟和MM/PBSA分析。最后，我们选择了两种优先候选化合物Z21和Z28，并进行体外和体内...
CRediT作者贡献声明
Ke Ren：撰写 - 原稿、可视化、方法论、调查、正式分析、数据整理。Pengshan Li：可视化、方法论、调查、数据整理。Jiacheng Liu：调查。Eyad Elkord：撰写 - 审阅和编辑、监督、项目管理、资金获取、概念构思。
伦理批准和参与同意
所有动物实验均按照国家标准动物实验总体要求（GB/T 35823–2018）进行，并按照西安交通大学利物浦大学研究伦理审查委员会批准的方案进行（ER-SRR-11000161020241017103725；日期：2024年10月22日）。本研究未涉及人类受试者，因此不需要患者知情同意。
知情同意和患者信息
已获得所有参与者或其法定代表人的书面知情同意，同意参与研究并发布文章。已遵守参与者的隐私权。
人体研究
本研究按照研究所在地的相关法律、监管框架和指南进行。本研究获得舟山普陀区人民医院医学伦理委员会批准（批准号：2023036KY）。
生成式AI和AI辅助技术在写作过程中的声明
在本工作的准备过程中，作者使用了ChatGPT和DeepSeek来辅助结果解释并改善语言和可读性。使用这些工具后，作者根据需要审阅和编辑了内容，并对出版物的内容承担全部责任。
资金
本研究由西安交通大学利物浦大学科学学部生物科学与生物信息学系支持。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争经济利益或个人关系可能影响本文所报道的工作。
Ke Ren|Pengshan Li|Jiacheng Liu|Eyad Elkord
