《Biomedicine & Pharmacotherapy》：Estrogen receptor modulation by a newly-identified cannabinoid in a preclinical model of breast cancer
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乳腺癌是一组异质性疾病，包含具有不同生物学行为和治疗应答的亚型。表达雌激素受体α（ERα）并依赖雌激素生长的肿瘤约占所有乳腺癌病例的65%。此类乳腺癌的常用内分泌治疗包括选择性雌激素受体调节剂（SERMs），如他莫昔芬。然而，尽管获益明确，许多患者因不良反应未
乳腺癌是一组异质性疾病，包含具有不同生物学行为和治疗应答的亚型。表达雌激素受体α（ERα）并依赖雌激素生长的肿瘤约占所有乳腺癌病例的65%。此类乳腺癌的常用内分泌治疗包括选择性雌激素受体调节剂（SERMs），如他莫昔芬。然而，尽管获益明确，许多患者因不良反应未能完成推荐的5年甚至10年疗程。医用大麻越来越多地被癌症患者使用，主要用于姑息治疗，但其在乳腺癌中的直接抗肿瘤潜力仍知之甚少。
目的：探讨大麻来源化合物是否对乳腺癌具有选择性抗肿瘤作用，并阐明其潜在的分子机制。
研究设计：结合多种ER阳性乳腺癌细胞系的体外实验，以及雌激素依赖性异种移植小鼠模型的体内验证。
方法：对代表不同分子亚型的乳腺癌细胞系进行评估。初步筛选一组化学组成各异的大麻提取物的细胞毒性活性，随后与SERMs联合检测。采用ESI-LC/MS对大麻提取物进行化学分析。通过植物大麻素分级分离、化学分析和结构解析，从初步筛选中唯一鉴定出与他莫昔芬联用有效的CANN14大麻提取物中分离并表征具有生物活性的植物大麻素。利用分子和生化实验在体外研究该植物大麻素的作用机制。最后，使用雌激素依赖性ER阳性乳腺癌异种移植小鼠模型评估其体内抗肿瘤疗效。
结果：研究发现一种独特的大麻提取物CANN14，能够使ER阳性乳腺癌细胞对他莫昔芬的细胞毒作用增敏。研究人员鉴定出一种新型植物大麻素373.15b，该化合物可模拟全提取物的效应且本身无毒性。其结构为带有芳香环乙酸酯基团的二羟基苯酚，与已知大麻素骨架截然不同。大麻素373.15b通过降低ERα的mRNA和蛋白表达水平及其转录活性来调节雌激素信号，其机制可能涉及RASSF1A和Hippo信号通路组分。在体内小鼠模型中，373.15b治疗可减小肿瘤体积和重量，与他莫昔芬联合使用时效果更为显著。
结论：本研究鉴定出一种新型大麻素，可调节ERα信号并增强SERMs的抗肿瘤疗效。研究结果表明，373.15b与SERMs联合治疗可能允许降低常规治疗剂量，从而减少相关不良反应并改善患者生活质量。
一句话总结：新鉴定的大麻素373.15b通过RASSF1A和Hippo信号通路降低ERα表达和活性，从而发挥抗肿瘤作用。
研究背景与意义
乳腺癌是全球女性中最常被诊断的癌症，也是癌症死亡的主要原因。乳腺癌并非单一疾病，而是包含多种具有不同病理和临床特征的生物学亚型，传统上根据雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体2（HER2）三种关键蛋白的表达分为四种主要分子亚型。表达ER并依赖雌激素驱动增殖和肿瘤生长的肿瘤约占所有乳腺癌病例的60%-70%。在正常细胞中，ER介导雌激素类固醇激素（最常见为雌二醇）的应答，通过配体依赖性激活发挥作用。在癌细胞中，雌二醇刺激生长并支持肿瘤发展。针对ER阳性乳腺癌，主要治疗策略是抑制ERα活化的内分泌治疗，包括芳香化酶抑制剂（AIs）、选择性雌激素受体调节剂（SERMs）和选择性雌激素受体降解剂（SERDs）。他莫昔芬（TAM）作为SERM类药物，数十年来一直是激素反应性乳腺癌的一线内分泌治疗选择，并被世界卫生组织列为乳腺癌治疗的基本药物。然而，TAM需至少服用五年，尽管完成全程治疗获益明确，仍有约三分之一至二分之一的患者提前终止治疗，主要原因是长期用药的不良反应。这些因素促使研究人员探索TAM与其他药物或抗肿瘤药联合使用的可能性。
植物大麻素是大麻植物（Cannabis sativa L.）的次生代谢产物，是ER阳性乳腺癌研究领域有前景的化合物。最丰富和知名的植物大麻素是具有精神活性的Δ?-四氢大麻酚（THC）和大麻二酚（CBD），但已鉴定出超过140种不同的植物大麻素。大麻已被用于癌症患者的姑息治疗，以缓解疼痛、恶心并刺激食欲。研究人员此前已证明不同大麻提取物可损害特定癌细胞系的存活和增殖，但ER阳性乳腺癌细胞系对所用大麻提取物最不敏感。因此，研究人员着手测试大麻与内分泌治疗联合使用是否可能对这些细胞产生显著效应，从而可能被视为一种新疗法。
研究内容与主要发现
研究人员首先对29种不同大麻提取物在三种乳腺癌细胞系（MDA-MB-436代表三阴性乳腺癌TNBC型、HCC1428代表PR+/HER2+且ER表达较低、MCF7代表ER+/PR+且无HER2表达）中的细胞死亡诱导能力进行了初步筛选。结果显示，MCF7细胞对所有检测提取物均具有抵抗性。当将相同提取物与低浓度（5 μM）TAM（其本身不引起细胞死亡）联合使用时，THC丰富的提取物CANN14与TAM联用对MCF7细胞死亡具有最大效应。在另外两种ER阳性乳腺癌细胞系ZR-75-1和T47D中也观察到类似效应。时序实验表明，先用CANN14处理再用TAM处理可显著增加细胞死亡，但顺序相反则无效，说明大麻提取物使ER阳性乳腺癌细胞对TAM的细胞毒作用增敏。
为进一步验证CANN14是否特异性针对TAM，研究人员测试了其他两种SERMs（托瑞米芬TOR和4-羟基他莫昔芬4-HT）。结果显示，CANN14与任何SERM联用均显著增加所有乳腺癌细胞系的细胞死亡，表明CANN14的效应并非TAM特异性，而是通过调节ER发挥作用。机制研究表明，CANN14处理以时间依赖性方式显著降低ERα在细胞核中的积累，且ERα蛋白水平在细胞核和细胞质中均显著降低，提示CANN14并非影响ERα向细胞核的转运，而是降低细胞中ERα蛋白的整体表达。进一步研究发现，CANN14处理显著降低ESR1基因表达、ERα与ERE的结合活性（荧光素酶报告基因实验）以及ERα靶基因（AR、CDC25A、GREB1、PGR、TFF1）的表达水平。
为鉴定CANN14中负责与TAM协同效应的特异性代谢物，研究人员将CANN14通过制备型HPLC/UV分为四个组分（F1-F4）。F2和F3组分与TAM联用可达到与全提取物相似的凋亡率。由于F3几乎完全由THC组成，研究人员将纯THC与F2组分和TAM联用，获得了相同效果。进一步将F2分为四个亚组分（F2A-F2D），LC-MS分析发现一种新型植物大麻素373.15b存在于F2A、F2B和F2C中，而大麻酚（CBN）存在于F2B、F2C和F2D中。THC、CBN和373.15b三者联合与TAM联用可达到与CANN14相似的凋亡率。当373.15b以高于其在CANN14中浓度100倍的剂量（2 μg/ml）单独使用时，可显著诱导凋亡并降低ERα蛋白水平、ESR1表达及ERα靶基因表达。
通过LC-MS/MS精确质量测定和1H/13C核磁共振（NMR）光谱分析，研究人员解析了373.15b的结构：其为带有芳香环乙酸酯基团的二羟基苯酚，包含三个酚羟基（典型大麻素骨架通常含两个），与已知大麻素骨架截然不同。合成373.15b在MCF7、T47D和ZR-75-1细胞中均有效降低ERα蛋白表达。通过使用CB?、CB?、GPR55、GPR30、TRPV1、TRPV2及Gαq蛋白的拮抗剂或反向激动剂预处理，均未能阻断373.15b对ERα的下调作用，提示其效应可能通过非经典内源性大麻素系统受体介导。
为阐明373.15b下调雌激素信号通路的机制，研究人员进行了RNA测序分析。差异表达基因的功能富集分析显示，上调基因显著富集于程序性细胞死亡的正向调控和未折叠蛋白反应，下调基因富集于有丝分裂细胞周期过程。上调转录本包括RASSF1和Hippo核心激酶组件STK3、STK4、SAV1和LATS2。RASSF1A是一种肿瘤抑制基因，已知在多种癌症中失活，包括ER阳性乳腺癌。研究发现，合成373.15b处理2小时后RASSF1A mRNA和蛋白水平显著增加。RASSF1A通过抑制AKT1活性降低ERα水平，373.15b处理后AKT1磷酸化在60分钟时即显著下降。此外，MST1/2和LATS1的磷酸化在30分钟后增加，120分钟时达到统计学显著，活性YAP在2小时后下降并在4和8小时显著降低。c-Myc（ERα靶点且被RASSF1A下调的原癌基因）及其下游靶点Cyclin D1的表达在处理后也显著下降。
在体内验证中，研究人员使用雌激素依赖性ER阳性乳腺癌异种移植小鼠模型（雌性裸鼠皮下植入0.36 mg缓释雌二醇 pellets，一周后注射MCF7细胞）。CANN14（25 mg/kg）与TAM（2 mg/kg）联合治疗40天后，肿瘤体积约为载体对照组的25%，显著低于CANN14单独治疗组；肿瘤重量约为其他各组的一半。用合成373.15b（15 mg/kg）替代CANN14重复实验，373.15b单独治疗组和联合治疗组在治疗开始后一周（第18天）即出现显著肿瘤体积差异，肿瘤重量在所有治疗组均显著降低，373.15b单独和联合治疗组更为显著。
技术方法
研究采用的主要技术方法包括：体外细胞实验（多种ER阳性乳腺癌细胞系MCF7、T47D、ZR-75-1及TNBC细胞系MDA-MB-436、HCC1428）；大麻提取物制备与化学分析（UHPLC/UV和ESI-LC/MS）；植物大麻素分级分离（制备型HPLC/UV）与结构解析（LC-MS/MS精确质量测定、一维高分辨率1H和13C NMR光谱）；分子和生化实验（Western blot、实时PCR、荧光素酶报告基因实验、共聚焦显微镜成像、流式细胞术凋亡检测、RNA测序）；体内异种移植小鼠模型验证（雌性裸鼠，雌激素依赖性ER阳性乳腺癌模型）。
讨论与结论
讨论部分指出，医用大麻的使用在全球范围内不断增加，主要适应症是缓解化疗相关副作用。然而，大麻素的临床效应尚未完全明确，新出现的证据表明其治疗潜力可能超越症状管理。在乳腺癌领域，与大麻相关的研究主要在三阴性模型中进行，大麻素敏感性据报道与肿瘤侵袭性相关，ER阴性细胞系比ER阳性细胞更敏感。本研究发现ER阳性乳腺癌细胞系MCF7对数十种不同大麻提取物具有抵抗性。研究人员发现特定大麻化学型CANN14与不同SERMs联用可在较低抑制剂剂量下增加凋亡，且给药顺序至关重要。373.15b是一种首次在本研究中表征的新型大麻素，其骨架类似于前体大麻素大麻萜酚（CBG），但在芳香环上多了一个乙酸酯基团，含有三个酚羟基，乙酸酯基团增加了分子的极性和亲水性。其对表达ER的乳腺癌细胞的特异性使其成为药物开发的良好候选分子。关于作用机制，373.15b处理后RASSF1A增加，随后AKT1丝氨酸473磷酸化降低，AKT1被RASSF1A抑制后限制ERα的mRNA和蛋白表达及活性。另一条途径是Hippo通路：处理后MST1/2和LATS1/2活性增加，导致YAP1失活，进而降低ERα表达。ERα的抑制导致ER转录活性降低、ESR1表达下降和ER靶基因（包括c-Myc和Cyclin D1）下调。在体内模型中，CANN14或373.15b与他莫昔芬联用比各自单独治疗更有效地减少肿瘤进展。研究结果支持使用经实验筛选的大麻来源组分与内分泌治疗联合。在ER阳性乳腺癌中，增强治疗疗效可能允许降低SERMs剂量，从而减轻不良反应并改善患者依从性和生活质量。
