基于石墨烯晶体管的疟疾寄生虫DNA检测芯片实验室平台

《Biosensors and Bioelectronics》：Lab-on-chip platform for detection of malaria parasite DNA with graphene transistors

　　

摘要：
快速、精准的疟疾床旁诊断至关重要，尤其需要能够区分由不同疟原虫物种引起的混合感染，这对于疟疾防控计划不可或缺。对特定物种的鉴定是选择适当治疗方案和预防复发的关键。此外，更便捷且非侵入性的感染检测方法可大幅减少感染病例数量，并最大限度地降低疫情对公共健康和经济造成的影响。本文报道了一种石墨烯电解质门控场效应晶体管（EG-gFET）阵列，用于构建DNA生物传感器，实现了对五种疟原虫物种DNA的高灵敏检测。该21通道芯片分为7个区域用于多重检测，集成了非共价功能化的石墨烯与靶向各物种的单链DNA探针。该微型读出平台允许在沉积少量分析物后直接进行无扩增测量。合成靶标DNA在生理缓冲液和25倍稀释唾液中均被检测到，检测限达阿托摩尔级别，动态范围跨越四个数量级以上，灵敏度约为16–19 mV/decade。值得注意的是，从恶性疟原虫培养物中提取并掺入人唾液中的DNA，在约10 aM浓度下仍可被可靠检测到。在单个芯片上进行7个功能化区域的混合靶标多重实验，证明了不存在靶标间串扰。在65°C下进行的加速老化实验表明芯片仍能保持分析性能。该平台可直接、无扩增地鉴定多种疟原虫物种，并可应用于非侵入性样本。其灵敏性、特异性和便携性的结合使该生物传感器成为资源有限或野外环境中早期疟疾筛查和物种鉴定的有力工具。

引言：
疟疾仍是全球最严重的寄生虫传染病之一。根据世界卫生组织（2025年）的数据，2024年全球估计有2.82亿例疟疾病例和约61万人死亡。五岁以下儿童仍遭受不成比例的影响：在受重灾的非洲地区，2024年近四分之三（约75%）的疟疾死亡发生在5岁以下儿童中。因此，尽管经历了数十年的进步，疟疾仍持续造成沉重代价，尤其是最年幼和最脆弱的人群。该疾病由疟原虫属的寄生虫原虫引起，其中恶性疟原虫是最具毒性和致死性的物种，在热带和亚热带地区尤为普遍（Escalante & Pacheco, 2019；Sato, 2021）。恶性疟原虫（P.f.）可引起严重疟疾（Mathison & Pritt, 2017），导致红细胞快速破坏、急性贫血和肾衰竭（Falade & Simeon, 2023；Weiland, 2023；Weiss et al., 2019）。尽管恶性疟原虫是全球最常见的感染，但还有另外四种疟原虫物种：间日疟原虫（P.v.）、三日疟原虫（P.m.）、卵形疟原虫（P.o.）和诺氏疟原虫（P.k.）也可感染人类（Sato, 2021）。在恶性疟原虫占主导的地区，这些物种往往被低估，导致误诊和不当治疗。间日疟原虫和卵形疟原虫因能从休眠肝脏阶段（休眠子）复发而带来特殊挑战。三日疟原虫可引起慢性、通常未被检测到的感染，并可能导致肾脏并发症；诺氏疟原虫是东南亚日益引起关注的问题，以其快速进展和潜在严重性著称。虽然大多数诺氏疟原虫感染无症状，但约19%的感染者可能发展为重症，且死亡与延迟静脉注射治疗有关（Mahittikorn et al., 2021）。疟疾症状通常缺乏特异性，类似流感样疾病，或根据感染物种和患者免疫反应而有所变化（Bria et al., 2021；Laishram et al., 2012；Talapko et al., 2019）。因此，早期、灵敏且具有物种特异性的诊断对于减轻疾病严重程度、预防并发症和控制传播至关重要。根据世界卫生组织（WHO）和创新诊断基金会（FIND）（Du et al., 2020；Maltha et al., 2013；Mathison & Pritt, 2017），快速诊断检测（RDT）在疟疾诊断和控制中发挥着至关重要的作用，尤其是在流行地区（Maltha et al., 2013；Mathison & Pritt, 2017），通过降低发病率和死亡率（Bell et al., 2016）。然而，尽管RDT提供快速、用户友好的结果，但它们通常灵敏度有限，导致假阳性或假阴性。此外，大多数RDT无法检测亚临床感染，且主要面向恶性疟原虫的诊断开发，这可能会延迟适当治疗并促进一步疾病传播（Koita et al., 2012；Lee et al., 2012；Wampfler et al., 2013）。尽管一些商业RDT现在可以区分恶性疟原虫与非恶性疟原虫物种（P.v、P.m、P.o）的混合感染，但它们对非恶性疟原虫物种的灵敏度仍然欠佳，检测P.m、P.o和P.k的效果较差。缺乏能够针对单个非恶性疟原虫物种、混合感染和亚感染进行多重检测的RDT仍然是一个重大缺陷（Abba et al., 2014；Parr et al., 2021）。实时聚合酶链反应（qPCR）和实验室分析等分子生物学方法为疟疾诊断提供了无与伦比的灵敏度（Berzosa et al., 2018；Bourgeois et al., 2010；Siwal et al., 2018）；然而，它们不适用于资源有限环境的床旁使用。为弥补RDT的局限性，如环介导等温扩增（LAMP）等替代床旁方法已被探索，因其具有类似PCR的灵敏度（Ameri et al., 2014），但它们仍然面临多重检测的适应性挑战，考虑到主混合液的复杂性（Hayashida et al., 2017；Lai et al., 2023）。缺乏能够准确鉴定单个非恶性疟原虫物种、检测混合感染和发现亚临床感染的RDT代表了主要的诊断差距（Abba et al., 2014；Parr et al., 2021）。准确的物种水平鉴别对于适当的疟疾治疗至关重要，因为不同物种需要不同的治疗方案。当前RDT的局限性阻碍了个性化治疗和最佳疾病管理。

最近，电解质门控石墨烯场效应晶体管（EG-gFET）已成为适用于床旁使用的基因组传感器的有前景解决方案（Ameri et al., 2014；Calderaro et al., 2024；Green and Norton, 2015；Krampa et al., 2020；Purwidyantri et al., 2023a；Stine et al., 2013）。石墨烯卓越的电荷载流子迁移率及其独特的双极性传输特性可实现超灵敏生物传感器（Geim & Novoselov, 2007；Novoselov et al., 2004；Tiwari et al., 2020）。我们之前的工作估计生物分子探针密度可达1.3×1013 cm?2（Domingues, Liao, et al., 2025），提供了阿托摩尔级的检测限（Domingues et al., 2025）。这些传感器可以检测微量DNA，无需DNA扩增循环或复杂设备（Huang et al., 2024；Ma et al., 2024；Zhang et al., 2024）。EG-gFET传感器的极低检测水平也使其能够使用唾液等非侵入性样本，这些样本通常含有较低的DNA含量。当前疟疾RDT依赖血液样本，虽然可提供高寄生虫血症，但需要采集毛细血管血。该方法具有侵入性，在儿科人群中尤为困难，通常需要约束并在家长协助下进行（Lenicek Krleza et al., 2015），且相当比例的儿童在操作过程中感到疼痛（Guerra Valero et al., 2022）。此外，侵入性还意味着往往在发展中国家环境中不可得的技术和临床物流支持。鉴于疟疾流行地区重复检测很常见，当前方法的侵入性构成了重大障碍。因此，能够采集非侵入性样本是诊断项目更广泛采用的重要一步，尤其是针对儿科人群和社区健康活动。此外，可接受性研究显示，如果能提供相当的灵敏度，人们对基于唾液的诊断工具具有强烈偏好（Owusu et al., 2021）。使用EG-gFET基唾液检测疟原虫物种结合了更高的灵敏度、相比纸质RDT更高的多重检测不同疟疾物种的能力，并且提供了使用非侵入性样本的可能性，在儿科患者中更容易采集，从而扩大了准确疟疾诊断的可及性。

我们的新型EG-gFET生物传感器以其能够在非侵入性唾液样本中同时检测多种单个疟原虫物种的能力为特色，实现准确的协同检测，并提供适用于资源有限环境中床旁使用的综合诊断工具。通过在RDT快速、可及的格式下实现通常仅限于实验室检测的分析准确性，我们的EG-gFET传感器为疟疾诊断提供了变革性的方法，确保有效疾病管理所需的可靠性。其更广泛的部署可能显著增强早期检测、优化治疗决策，并为全球疟疾控制和消除工作做出贡献。

材料部分：
实验中使用的所有化学品均为分析纯级别；Millipore水（MQ，18 MΩ·cm，Millipore，Bedford，MA，USA）和Millipore无RNase/DNase水也被使用。六水合氯化镁、氯化钠、磷酸钠、磷酸氢二钠一水合物、1-十二烷硫醇、1-芘丁酸琥珀酰亚胺酯（PBSE）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、异丙醇和乙醇胺（ETA）购自Sigma-Aldrich。所有合成DNA序列均为……

EG-gFET表面表征：
拉曼光谱用于评估EG-gFET通道中石墨烯的结构质量和层数（532 nm激发；代表性光谱见图S3–S4）。观察到了特征性的G（~1585 cm?1）、2D（~2691 cm?1）和D（~1351 cm?1）峰。I?D/IG比值分析表明通道区域主要为双层石墨烯，存在单层石墨烯区域且缺陷密度较低，这由微弱的D峰强度所证实。2D峰的形状、位置……

结论：
我们展示了基于EG-gFET的生物传感在多重疟疾诊断中的潜力。我们使用了一种具有7个传感区域的石墨烯基传感器芯片和微型电子平台，允许传感区域同时或独立使用，作为一种简单的滴涂快速诊断检测，无需微流控。单层/双层石墨烯生物传感器表现出适合阿托摩尔检测的高性能参数。我们设计了6个对应不同靶标的DNA探针……

作者贡献声明：
Neide Vieira：调查。Bruno Almeida：调查。Chun-Da Liao：调查。Andrey Ipatov：调查。Pedro Alpuim：撰写—审阅与编辑，监督，方法学。Jo?o Rodrigues：调查。Telma Campos Domingues：撰写—初稿，验证，软件，调查，数据整理。Jér?me Borme：撰写—审阅与编辑，项目管理，方法学，概念化。Ivo Colmiais：调查。Pedro Ferreira：撰写—审阅与编辑……

未引用参考文献：
加速老化规划器；Falade和Simeon，2021；医疗设备无菌屏障系统加速老化指南，2021；Muchen，2019；Purwidyantri等人，2023。

利益冲突声明：
J.B、J.R、P.E.F、N.V和B.A是欧盟专利EP4298243A1的共同发明人，也是IPLEXMED的联合创始人，该公司开发DNA生物传感器诊断产品。

利益冲突声明：
? 作者声明以下财务利益/个人关系，可能被视为潜在的利益冲突：Joana Guerreiro拥有GRAPHENE-BASED MALARIA SENSOR, METHODS AND USES THEREOF专利，授权中。如果还有其他作者，他们声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本报告所述工作。

致谢：
本项目获得欧盟Horizon 2020研究与创新计划资助，资助协议编号777222。T.D.和A.F.G.分别感谢葡萄牙科学与技术基金会（FCT）的博士研究奖学金（SFRH/BD/08181/2020）和（https://doi.org/10.54499/2022.12892.BD）。本工作由国家资金通过科学与技术基金会（FCT）资助，项目包括UID/06304/2025（https://doi.org/10.54499/UID/06304/2025）和……

Telma Domingues | Joana R. Guerreiro | Adriana F. Gon?alves | Jo?o Rodrigues | Ivo Colmiais | Andrey Ipatov | Chun-Da Liao | Bruno Almeida | Neide Vieira | Pedro Alpuim | Pedro E. Ferreira | Jér?me Borme