《Veterinary Sciences》：Genomic Characterization of a Multidrug-Resistant ST88 Enterotoxigenic/Shiga Toxin-Producing Hybrid Escherichia coli Isolated from a Pig in Korea
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产肠毒素/产志贺毒素杂合大肠杆菌（ETEC/STEC）菌株携带两种致病变型的毒力决定因子，并可能携带多种抗菌耐药（AMR）决定因子。研究人员对从韩国断奶后仔猪分离的ETEC/STEC杂合株GCUHS-1A的完整基因组和抗菌耐药谱进行了表征。分子和生物信息学分析
产肠毒素/产志贺毒素杂合大肠杆菌（ETEC/STEC）菌株携带两种致病变型的毒力决定因子，并可能携带多种抗菌耐药（AMR）决定因子。研究人员对从韩国断奶后仔猪分离的ETEC/STEC杂合株GCUHS-1A的完整基因组和抗菌耐药谱进行了表征。分子和生物信息学分析鉴定了毒力基因和抗菌耐药基因、质粒复制子、前噬菌体、血清型和序列型，同时通过最低抑菌浓度（MIC）检测评估了抗菌药物敏感性。5.64-Mb基因组由1条染色体和7个质粒组成。GCUHS-1A被判定为序列型88（ST88）和血清型O-untypable:H11。质粒携带的eltAB和F18ac菌毛基因以及前噬菌体编码的stx2e确认了其ETEC/STEC杂合特征。该菌株对16种抗菌药物耐药，并携带多个获得性耐药基因和喹诺酮耐药相关的gyrA替换。尽管存在头孢菌素耐药且超广谱β-内酰胺酶（ESBL）表型确证试验阳性，但未检测到获得性ESBL或质粒介导的ampC基因。据研究人员所知，GCUHS-1A是韩国首次报道的猪源ST88 ETEC/STEC杂合株的完整测序菌株。这些发现为猪源ST88 ETEC/STEC杂合株提供了基因组参考，阐明了毒力决定因子与多重耐药决定因子的模块化共存，并突出了整合表型与基因组耐药分析的价值。
研究背景方面，产肠毒素大肠杆菌（ETEC）和产志贺毒素大肠杆菌（STEC）是重要的致腹泻致病变型，二者毒力机制不同。ETEC通过热不稳定和/或热稳定肠毒素破坏肠道液体与电解质稳态，引起分泌性腹泻，并通过菌毛黏附素（如F4/K88和F18）介导肠道定植；STEC产生志贺毒素（Stx），其中Stx2e与猪水肿病及血管内皮损伤相关。传统上ETEC和STEC被视为不同致病变型，但全球不断报道同时携带两类毒力决定因子的杂合株。猪是致病性大肠杆菌谱系的重要储存宿主，且质粒、噬菌体等移动遗传元件可促使毒力与抗菌耐药（AMR）决定因子共存和传播。ST88已在不同地理和宿主来源的大肠杆菌中报道，日本和台湾地区已有猪源多重耐药ST88 STEC/ETEC杂合株报道；包括Lee et al.在内的既往韩国研究报道了畜禽及动物源食品中不同序列型（ST）的STEC/ETEC杂合株，但尚无韩国猪源ST88 ETEC/STEC杂合株完整基因组特征的信息。因此，研究人员对GCUHS-1A进行完整基因组和耐药谱表征，以确定主要毒力决定因子的基因组定位并刻画其AMR特征；该研究提供了韩国猪源ST88 ETEC/STEC杂合株的基因组参考，并说明毒力与多重耐药决定因子可在单一菌株中模块化共存，同时强调表型与基因组耐药分析整合的价值。
关键技术方法方面，菌株GCUHS-1A于2024年分离自韩国私人猪场断奶后腹泻仔猪粪便样本。研究人员采用PCR筛查13个毒力相关靶标；使用PacBio Revio HiFi长读长和Illumina NovaSeq X短读长进行全基因组测序（WGS），经SMRT Link组装、Inspector校正和Pilon抛光，并以BUSCO评估基因组完整性；利用VirulenceFinder、SerotypeFinder、PubMLST、PlasmidFinder、MOB-suite、PHASTEST和综合抗生素耐药数据库（CARD）的耐药基因标识（RGI）等分析毒力基因、血清型、ST、质粒复制子、前噬菌体和AMR决定因子；采用梯度扩散法和肉汤微量稀释（BMD）测定最低抑菌浓度（MIC），按CLSI判读，并以组合纸片法进行超广谱β-内酰胺酶（ESBL）表型确证，使用ATCC 25922质控。
研究结果如下。3.1 一般基因组特征与分子分型：通过完整基因组测序、组装和注释，GCUHS-1A基因组长5,642,884 bp，G + C含量50.4%；染色体5,121,764 bp，G + C含量50.7%，另含7个质粒（5128–251,129 bp）。注释获得5491个预测编码序列（CDS）、22个rRNA基因和100个tRNA基因；8个contig均报告为环状，染色体平均深度60×，质粒相关contig平均深度54×–136×；Illumina和PacBio HiFi读段映射率分别为99.55%和99.99%，覆盖度均为100%；BUSCO分析回收124个完整单拷贝直系同源标记。分子分型将菌株归为ST88、克隆复合群23（CC23），血清型为O-untypable:H11；O型无法分型被解释为in silico O基因型未解决，并不表示缺乏O抗原。基于27株ST88基因组的系统发育分析提供了比较背景；原文指出ST本身不足以定义致病变型，致病变型判定应基于已确立毒力决定因子的组合及基因组背景。
3.2 毒力决定因子分布：PCR筛查与WGS一致检出ETEC和STEC相关毒力决定因子，包括热不稳定肠毒素操纵子eltAB、F18菌毛基因簇和志贺毒素2e基因stx2e。完整基因组组装将stx2e定位在一个预测为intact的染色体前噬菌体区域（78.8 kb，G + C含量49.38%，常见参考噬菌体为PHAGE_Entero_phiP27），eltAB位于质粒2，F18菌毛基因簇位于质粒3；F18ac变体依据编码主要菌毛亚单位的fedA-ac等位基因判定。PHASTEST预测9个染色体前噬菌体区域，其中7个为intact。质粒移动性预测显示，质粒1和质粒2可能为接合型（分别携带MOBH型及MOBF/MOBP型松弛酶），质粒3–7可能为可移动型（质粒4为MOBQ型，质粒5和7为MOBP型，质粒3和6未检出松弛酶）。原文强调这些移动性分类为计算预测而非实验证明的质粒转移，且单株分析不能确定这些元件的获得时间或来源。该结果说明GCUHS-1A的主要毒力决定因子以质粒和前噬菌体模块化组织，支持其ETEC/STEC杂合分类。
3.3 抗菌耐药表型与基因型：通过MIC梯度扩散和BMD，GCUHS-1A对16种抗菌药物耐药，包括氨苄西林、哌拉西林、阿莫西林-克拉维酸、哌拉西林-他唑巴坦、头孢噻肟、头孢曲松、头孢他啶、头孢西丁、卡那霉素、四环素、环丙沙星、左氧氟沙星、萘啶酸、氧氟沙星、氯霉素和甲氧苄啶-磺胺甲噁唑；对头孢吡肟、亚胺培南、厄他培南、美罗培南、阿米卡星、庆大霉素和多西环素敏感，符合多重耐药（MDR）定义。BMD确认对头孢噻肟、头孢曲松、头孢他啶和头孢西丁耐药，头孢吡肟敏感；组合纸片法中头孢他啶和头孢噻肟抑菌圈在克拉维酸存在下均增加9 mm，ESBL表型确证试验阳性。基因组分析检出多种获得性耐药基因，包括氨基糖苷类耐药基因aph(3′)-Ia、aph(3″)-Ib、aph(6)-Id和aadA变体，tet(A)，sul1、sul2、sul3，dfrA1、dfrA12，cmlA1，以及喹诺酮耐药相关gyrA替换S83L和D87N；并检出质粒携带blaTEM-1B、染色体EC-13 class C β-内酰胺酶（与参考序列氨基酸一致性99.7%）、AcrAB-TolC相关外排决定因子及MarR替换G103S和Y137H。尽管头孢菌素耐药且ESBL表型阳性，未检出获得性ESBL或质粒介导ampC基因；ampC调控区比较未证明其与AmpC高产菌株E1或C16功能等价，EC-13被视为潜在贡献而非确认原因。原文总结称，检出基因和gyrA替换与氨苄西林、卡那霉素、四环素、氯霉素、喹诺酮/氟喹诺酮和甲氧苄啶-磺胺甲噁唑耐药一致，但三代头孢菌素、头孢西丁及受试β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂复方耐药未完全解释，支持表型药敏与基因组证据联合解释。
讨论部分总结：GCUHS-1A的完整基因组显示质粒携带的F18ac和eltAB与染色体前噬菌体相关stx2e共存，符合ST88 ETEC/STEC杂合株分类；菌株携带多个获得性耐药基因（ARGs）和染色体耐药相关决定因子，呈MDR表型，说明毒力与耐药决定因子可在单一菌株中模块化共存。完整基因组分析可定位决定因子位于染色体、质粒或前噬菌体，为韩国猪源ST88 ETEC/STEC杂合株提供基因组参考；但质粒移动性和前噬菌体intact分类均为计算预测，未实验验证转移或诱导性，单株分析也不能确定获得历史。原文指出本研究仅分析一株分离株，未评估毒力基因表达或前噬菌体诱导性，也未解决β-内酰胺耐药表型的分子机制，因此该分离株的致病潜力和更广泛流行病学意义仍有待确定。
研究结论（翻译）：综上，对GCUHS-1A完整基因组的分析显示，质粒携带的F18ac和eltAB与前噬菌体相关stx2e共存，符合该菌株被归类为ST88 ETEC/STEC杂合株。该菌株携带多个获得性耐药基因（ARGs）和染色体耐药相关决定因子，并表现为MDR表型。据研究人员所知，这是韩国首次报道的猪源ST88 ETEC/STEC杂合株的完整基因组序列。然而，本研究仅分析了一株分离株，未评估毒力基因表达或前噬菌体诱导性，也未阐明β-内酰胺耐药表型背后的分子机制。因此，该分离株的致病潜力及更广泛的流行病学意义仍有待确定。
