爱泼斯坦-巴尔病毒BRRF1蛋白在转录后RNA调控中的新功能

《Journal of Virology》：Novel roles of the Epstein-Barr virus BRRF1 protein in post-transcriptional RNA regulation

　　

摘要专业翻译 在裂解性感染中，爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV）蛋白通过多种方式操纵细胞过程以促进病毒粒子产生并克服宿主抗病毒反应。本研究筛选了一个EBV裂解期蛋白库，寻找那些能够操纵或定位于细胞加工小体（PBs）的蛋白——PBs在RNA监视和miRNA介导的翻译调控中发挥重要作用。研究人员鉴定出一种EBV蛋白BRRF1可部分定位于PBs，亲和纯化-质谱实验显示其与CCR4-NOT复合物相互作用——该复合物是PBs的已知组分，在mRNA转录后调控中具有多重作用。CCR4-NOT的CNOT9亚基足以结合BRRF1，且下调CNOT9会减弱BRRF1与支架蛋白CNOT1的相互作用，表明CNOT9在介导CCR4-NOT与BRRF1的结合中至关重要。研究人员构建了一种无法结合CNOT9或与CCR4-NOT相互作用的BRRF1双点突变体，用以评估BRRF1-CCR4-NOT相互作用的重要性。荧光素酶报告基因检测揭示了BRRF1在转录后调控中的多重作用，包括依赖多聚腺苷酸化的去稳定效应以及对miRNA功能的干扰，后者依赖于BRRF1与CCR4-NOT的结合。此外，比较表达与不表达BRRF1细胞的mRNA测序实验鉴定出多个受BRRF1影响的转录本，其中部分至少在一定程度上依赖于BRRF1-CCR4-NOT相互作用。这些转录本包括Claudin 6，其转录本和蛋白水平在单独表达BRRF1时以及裂解性感染中均被下调。因此，研究人员确定了BRRF1在mRNA转录后调控中的多重作用，其中一些涉及与CCR4-NOT的相互作用。

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研究背景与科学问题

爱泼斯坦-巴尔病毒（Epstein-Barr virus，EBV）是一种人类γ-疱疹病毒，其终身感染与伯基特淋巴瘤、移植后淋巴增殖性疾病、鼻咽癌和胃癌等多种癌症密切相关，近期还被确定为多发性硬化症的重要诱因。EBV在潜伏感染和裂解性感染之间交替，裂解期涉及约80种EBV蛋白的表达，其中许多蛋白的功能尚不清楚。BRRF1（也称Na）是一种保守于γ-疱疹病毒的裂解期早期蛋白，由BZLF1与其启动子相互作用诱导表达。已有研究表明BRRF1可通过与c-Jun、肿瘤坏死因子受体相关因子2（TRAF2）和p53等细胞因子相互作用增强EBV裂解再激活，还能诱导G蛋白偶联受体EBI2的表达，影响多种细胞启动子驱动的荧光素酶报告基因表达，并抑制53BP1向DNA双链断裂位点的招募。然而，BRRF1发挥这些多样效应的分子机制仍不明确。

疱疹病毒蛋白可通过转录后机制调控细胞基因表达，例如调节mRNA稳定性、加工或翻译。加工小体（processing bodies，PBs）在RNA监视、RNA衰变与停滞、miRNA介导的沉默以及翻译调控中发挥重要作用。γ-疱疹病毒感染已被观察到会破坏PBs，表明改变PBs对促进病毒感染至关重要。例如，KSHV的Kaposin B和ORF57蛋白均可导致PBs解体，而EBV的BGLF2蛋白也能通过与Ago2/TNRC6相互作用减少PBs数量。基于此，本研究旨在通过筛选EBV裂解期蛋白中能够定位或破坏PBs的候选者，进而揭示其在转录后mRNA调控中的潜在功能。

研究方法概述

研究人员采用免疫荧光显微镜技术，在HeLa细胞中筛选了携带FLAG标签的EBV裂解期蛋白文库，以DCP1A作为PBs标志物，鉴定能够破坏或定位于PBs的病毒蛋白。随后利用亲和纯化偶联串联质谱（AP-MS）技术，在293T细胞中鉴定与BRRF1相互作用的细胞蛋白复合物。通过AlphaFold3结构预测和定点诱变技术，构建了BRRF1 Y224A/Y225A双点突变体（YY突变体）。采用λN肽系留实验和双荧光素酶报告基因检测系统，评估BRRF1对mRNA稳定性和miRNA功能的影响。利用mRNA测序（mRNA-seq）技术，在EBV阴性AGS胃癌细胞系的强力霉素诱导型BRRF1表达系统中鉴定差异表达基因，并通过RT-qPCR和蛋白质印迹法进行验证。最后，利用含有野生型或BRRF1敲除BACmid的AGS细胞系，在EBV裂解性感染背景下验证BRRF1对靶标转录本的调控作用。

研究结果

鉴定破坏或定位于P体的EBV蛋白

通过免疫荧光筛选，研究人员发现BGLF2、BBRF1、BVRF1和LF2四种EBV蛋白可使PBs数量减少超过30%，其中BBRF1的效果最为显著。此外，仅有BRRF1蛋白能持续定位于DCP1A阳性的PBs，且在HeLa、HONE1上皮细胞和AGS胃癌细胞中均观察到这一现象，表明BRRF1可能参与mRNA转录后调控。

BRRF1与CCR4-NOT相互作用

AP-MS实验结果显示，BRRF1与CCCR4-NOT复合物的10个亚基（CNOT1-3和CNOT6-11）发生显著相互作用。在AGS细胞中的共免疫沉淀实验证实了BRRF1与CNOT1的结合，且RNase处理不影响该互作，表明并非RNA介导。AlphaFold3预测和后续实验证明，BRRF1通过其Y224和Y225残基与CNOT9的GW口袋1结合，YY双点突变破坏了BRRF1与CNOT9及整个CCR4-NOT复合物的相互作用。

BRRF1-CCR4-NOT相互作用非P体定位所必需

在HeLa细胞中表达BRRF1 YY突变体后，其仍能以与野生型相似的频率定位于DCP1A和CNOT1标记的PBs，表明BRRF1的PBs定位不依赖于其与CCR4-NOT的结合。

报告基因检测揭示BRRF1在mRNA调控中的多重作用

在λN肽系留实验中，将BRRF1野生型或YY突变体系留至含SV40 poly(A)信号的报告转录本后，荧光素酶活性降至对照的约10%；使用含内部poly(A)尾和锤头核酶序列的抗降解报告基因时，抑制作用减弱但仍显著，表明BRRF1可通过多种方式下调mRNA，包括多聚腺苷酸化依赖性去稳定化。在非系留实验中，BRRF1野生型和YY突变体同样能抑制含poly(A)信号的报告基因，但对锤头核酶报告基因的抑制大幅减弱，提示多数效应通过poly(A)尾调控实现。重要的是，let-7a miRNA报告基因实验显示，野生型BRRF1可干扰let-7a的miRNA功能，而YY突变体无此效应，表明该功能依赖于BRRF1与CCR4-NOT的结合。

BRRF1以CCR4-NOT依赖性方式影响多种转录本

mRNA-seq分析鉴定出237个受BRRF1影响的基因，其中58个上调、179个下调。GO富集分析显示上调转录本富集于高尔基体囊泡运输和核苷/核苷酸生物合成，下调转录本富集于RNA剪接、糖蛋白代谢和病毒过程。RT-qPCR验证了EFNA3（上调）、SSR2和PPIB（下调）的变化，且YY突变体对这些转录本的调控效果减弱或消失。在EBV裂解性感染的AGS-EBV-Z细胞中，这些转录本的变化趋势与BRRF1表达一致。

BRRF1下调Claudin 6

mRNA-seq数据显示BRRF1使CLDN6转录本平均降低3.9倍。RT-qPCR和蛋白质印迹证实，在AGS-BRRF1细胞中诱导BRRF1表达后，CLDN6的mRNA和蛋白水平均下降。YY突变体对CLDN6的下调能力弱于野生型，表明该效应部分依赖于CCR4-NOT结合。在EBV裂解性感染中，CLDN6的mRNA和蛋白水平均降低，而在BRRF1敲除的BACmid感染细胞中，这种下调被部分恢复，证实BRRF1在裂解性感染中确实参与了CLDN6的调控。

讨论与结论

本研究通过结合PBs定位/破坏筛选和亲和纯化质谱技术，鉴定出BRRF1是一种潜在的转录后mRNA调控因子。BRRF1部分定位于PBs并与CCR4-NOT复合物相互作用，后者在mRNA转录后调控中发挥多重作用，包括去腺苷酸化、miRNA功能和翻译抑制。值得注意的是，BRRF1通过其Y224/Y225残基与CNOT9的GW口袋1结合，该口袋也是TNRC6蛋白与CCR4-NOT相互作用的关键区域，因此BRRF1可能通过竞争性结合干扰CCR4-NOT在miRNA功能中的作用。报告基因实验证实BRRF1可干扰miRNA功能，且该效应依赖于CCR4-NOT结合。mRNA-seq数据表明BRRF1可特异性上调或下调特定转录本，其中部分效应依赖于CCR4-NOT相互作用。CLDN6是一种紧密连接蛋白，在胎儿发育后通常不表达，但在多种癌症中上调并与不良预后相关。本研究发现BRRF1在EBV裂解性感染中下调CLDN6，提示这可能影响EBV相关的肿瘤发生过程。总体而言，本研究提出了BRRF1在转录后mRNA调控中的作用模型：BRRF1定位于PBs，通过与CNOT9的相互作用干扰CCR4-NOT在miRNA功能中的作用，从而特异性地调控靶标转录本的水平。