真菌表达平台Thermothelomyces heterothallica C1生产的抗宋内志贺菌O-抗原人源单克隆抗体的功能与保护能力

《Microbiology Spectrum》：Functional and protective capacity of a human monoclonal antibody against Shigella sonnei O-Antigen produced in fungal cells

　　

获得对最广泛使用抗生素产生耐药性的细菌物种数量正在持续增加。单克隆抗体（monoclonal antibodies, mAbs）是对抗抗生素耐药性最有前景的治疗选择之一。阻碍mAb疗法更广泛应用的一个主要障碍是高生产成本。在此，研究人员描述了一种人源单克隆抗体（human mAb）的生产过程，该抗体靶向宋内志贺菌（Shigella sonnei）的O-抗原（O-Antigen），由真菌生产平台（Thermothelomyces heterothallica C1，原名Myceliophthora thermophila）生产。该抗体以天然真菌糖基化或人源化糖基化形式产生，其体外功能活性和体内保护效力与在标准哺乳动物细胞中产生的抗体相当。C1平台的使用缩短了生产时间并加速放行，从而显著降低生产成本。该方法可促进新型治疗药物的公平可及，以应对全球健康挑战。

该研究围绕抗宋内志贺菌（Shigella sonnei）O-抗原（O-Antigen, OAg）的人源单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb）C-0302B17，评估其在低成本真菌表达平台Thermothelomyces heterothallica C1（原名Myceliophthora thermophila）中生产的可行性及功能与保护能力。抗微生物药物耐药性（antimicrobial resistance, AMR）持续威胁全球公共健康；志贺菌病每年约导致14.8万人死亡，主要集中在中低收入国家。志贺菌属对多种一线抗生素快速耐药，耐氟喹诺酮志贺菌已被列入世界卫生组织2024年细菌优先病原体清单。mAb是对抗AMR的有前景策略，但哺乳动物细胞生产方式成本高昂，妨碍其广泛应用。C1平台具有生产率高、培养基便宜、生产周期短、无需病毒清除等优势。研究人员选用此前证明对小鼠感染具有100%保护作用的S. sonnei OAg特异性mAb C-0302B17，在C1天然菌株和人源化糖基化菌株中表达，并以哺乳动物Expi293细胞产生的同一抗体为对照，系统比较其理化性质、体外功能及体内保护效力。

主要技术方法：将密码子优化的C-0302B17重/轻链克隆入C1表达载体，经CRISPR-Cas9转化蛋白酶缺陷型C1菌株DNL161（天然糖基化）和DNL172（人源化糖基化）；7天补料分批发酵后蛋白A亲和纯化。通过超高效液相色谱-荧光检测-高分辨质谱（UHPLC-FLR-HRMS）、完整蛋白分子量分析、体积排阻色谱（SEC）、差示扫描荧光法（DSF）及流式细胞术表征；体外功能用血清杀菌试验（SBA）、调理吞噬试验（OPA）和黏附/侵袭抑制试验（AIA）评价。体内研究使用Charles River Laboratories的雌性BALB/c小鼠（攻击组10只/组，药代动力学组5只/组），经鼻内致死量S. sonnei Moseley攻击，ELISA检测血清mAb浓度。

C1系统生产C-0302B17：经双点杂交和免疫印迹筛选高表达转化株，单克隆菌株在1 L补料分批反应器中表达，天然糖基化菌株产量为6.4 g/L，糖基化改造菌株为4.6 g/L；蛋白A一步纯化获得高纯度制品MT835/MT837，非还原SDS凝胶显示主要条带为150 kDa完整组装抗体。

生物物理表征：释放N-聚糖分析显示天然C1产物主要携带Man3-Man9及含额外HexNAc的杂合型聚糖，糖基化改造产物携带人源化G0、G1和G2聚糖。完整蛋白质量谱显示两种制品的预期分子量145,183.9 Da（精度1.5 Da）为主峰，另有+162 Da倍数加合物提示O-糖基化。SEC确认纯度和完整性；差示扫描荧光法测得的Fab熔解温度约80°C、Fc约60°C，其中C1天然菌株来源mAb的Fc熔点与哺乳动物细胞来源mAb相差2°C。流式细胞术测定活菌结合的解离常数（K_d）为18–26 nM，三者无显著差异。

体外功能等效：血清杀菌试验对S. sonnei 53G和Moseley株的半数抑菌浓度（IC₅₀）为22.9±10.5 ng/mL；调理吞噬试验中THP-1巨噬细胞摄取细菌的半数有效浓度（EC₅₀）为9.8 μg/mL；HeLa细胞黏附/侵袭抑制试验同样无显著差异。三种mAb制剂在所有体外试验中行为一致。

体内保护功效：预防性给药后，三种mAb均使致死量鼻内攻击的小鼠获得100%存活，而同型对照和PBS组存活率分别为10%和20%。药代动力学显示给药后第1天抗体水平达峰，哺乳动物细胞来源和C1糖基化改造来源mAb约为3000 ELISA单位，C1天然来源约低1000单位；C1来源mAb第8天不可检测，而哺乳动物细胞来源mAb第15天仍存在。

讨论总结：抗体生产平台的可负担性对中低收入国家尤为重要。C1系统相对中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary, CHO）具有高容积产量、低成本培养基、短发酵周期、无需病毒清除和快速获得生产菌株等内在优势。C1天然分泌酶产量可超过120 g/L，治疗性mAb产量可达20 g/L以上；糖基化工程可生成半乳糖基化双天线N-聚糖并消除高甘露糖型。产量上糖基化改造菌株低于天然菌株，转录组提示其蛋白质折叠和分泌应激增强，并已鉴定10个可改善产量的基因。产品完整性得益于宿主中14个蛋白酶基因缺失和KEX2蛋白酶弱化表达。N-聚糖谱显示糖基化改造产物98%为人源化聚糖，残留2% Man3；完整质量谱提示O-甘露糖基化。残留真菌聚糖的潜在免疫原性需在临床开发中关注；早期临床前和临床数据显示含C1聚糖的SARS-CoV-2候选疫苗和中和抗体耐受性良好。尽管N-糖基化模式不同，未影响体外和体内功能。C1来源mAb在小鼠血清中第8天已不可检测，可能与其O-聚糖介导的更快清除或ELISA检测抗体的识别差异有关；在丝状真菌中敲除蛋白O-甘露糖基转移酶（protein O-mannosyltransferase, pmt）基因可降低O-糖基化水平。研究局限性在于无法评价C1产物对耐药志贺菌临床分离株的活性，因为S. sonnei在实验室培养中常丢失编码OAg的毒力质粒pInv；所筛选的15株以上不同耐药谱临床分离株均无可检测OAg表达。

研究结论：综上所述，本研究提供概念验证，C1表达平台能够生产具有竞争力产量且与哺乳动物细胞来源抗体体内外功能相当的功能性抗志贺菌mAb。后续需在菌株工程、糖基化控制以及针对药代动力学和耐药临床分离株有效性的临床前研究方面继续推进，以实现该低成本生产系统在抗体干预全球健康中的潜力。