厌氧氨氧化细菌Kuenenia stuttgartiensis中细菌铁蛋白KsBfr（KSMBR1_0066）的纯化、鉴定与表征

《Microbiology Spectrum》：Purification, identification, and characterization of a bacterioferritin from the anammox bacterium Kuenenia stuttgartiensis

　　

厌氧氨氧化（anammox）细菌将铵和亚硝酸盐转化为氮气，并以一氧化氮和肼作为中间体。厌氧氨氧化反应发生在称为厌氧氨氧化体（anammoxosome）的专用细胞区室中，并被提出通过厌氧氨氧化体膜上的质子动力势（proton motive force, PMF）与能量转化相偶联。这种厌氧氨氧化能量代谢在很大程度上由含血红素（heme）的酶执行，这些酶的合成和正常功能依赖可利用铁。细菌铁蛋白（bacterioferritin, Bfr）是多聚体铁储存蛋白。模式厌氧氨氧化物种Kuenenia stuttgartiensis的基因组含有两个推定的细菌铁蛋白基因：KSMBR1_0066和KSMBR1_0230。在此，研究人员分离并表征了K. stuttgartiensis细菌铁蛋白KSMBR1_0066（KsBfr），并研究了细菌铁蛋白同源物在厌氧氨氧化基因组中的分布。KsBfr从K. stuttgartiensis细胞中纯化，并被鉴定为KSMBR1_0066。对厌氧氨氧化Brocadiales基因组中推定Bfr同源物的检索显示，大多数含有一个或两个同源物，且这些同源物聚类为两个不同组：bfr1和bfr2。KSMBR1_0066与bfr2聚类。纯化的KsBfr具有18-kDa单体大小，由14-nm宽颗粒组成，具有6-nm电子致密核心，并含血红素b，还原时吸收峰位于423、527和557 nm。分离态KsBfr可被卸载铁并随后重新装载铁。研究人员提出KsBfr参与K. stuttgartiensis细胞的铁储存，并推测厌氧氨氧化细菌铁蛋白可能在血红素生物合成中铁的使用和再利用方面发挥铁储存作用。

研究背景与科学问题：厌氧氨氧化（anammox）细菌在生物氮循环和废水脱氮中具有重要作用，可将铵（NH₄⁺）和亚硝酸盐（NO₂^?）经一氧化氮（NO）和肼（N₂H₄）转化为氮气（N₂）。该反应发生于厌氧氨氧化体（anammoxosome），并被认为通过厌氧氨氧化体膜上的质子动力势（proton motive force, PMF）与能量转化偶联。厌氧氨氧化能量代谢在很大程度上依赖含血红素（heme）的酶，这些酶的合成与正常功能依赖可利用铁。细菌铁蛋白（bacterioferritin, Bfr）是多聚体铁储存蛋白。模式菌Kuenenia stuttgartiensis基因组含两个推定Bfr基因KSMBR1_0066和KSMBR1_0230，二者均表达，且此前提出其可能参与铁储存。由于厌氧氨氧化细菌生长慢、缺乏纯培养和固体培养基生长，尚无遗传操作工具，生理生化研究成为主要手段；同时，heme生物合成尚未完全阐明，c型细胞色素（c-type cytochromes）和铁硫蛋白（iron-sulfur proteins）释放铁需要紧密偶联的生物合成/拆解过程和/或铁储存系统，氧敏感heme与铁硫蛋白需防止氧暴露，厌氧菌解毒氧时产生的H₂O₂与Fe²⁺可经Fenton反应（Fenton reaction）生成活性氧（reactive oxygen species, ROS），因此铁需储存在远离氧和H₂O₂的位置。研究人员据此从K. stuttgartiensis细胞中纯化、鉴定并表征KSMBR1_0066（KsBfr），并调查Bfr同源物在anammox基因组中的分布。该研究确认KsBfr为含heme b的Bfr，揭示其铁装载能力及anammox Bfr的分布特征，提出其在铁储存及heme生物合成中铁使用/再利用中的潜在作用，并否定厌氧氨氧化体颗粒为Bfr的假说。

关键技术方法（≤250字）：样本为12-L连续膜生物反应器中约95%纯度富集培养的K. stuttgartiensis MBR1细胞。关键技术包括铵盐分级与羟基磷灰石层析纯化、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-ToF MS）鉴定、紫外-可见（UV-Vis）光谱、动态光散射（DLS）、负染透射电子显微镜（TEM）及铁卸载/再装载；并对Brocadiales基因组进行CheckM2质控、blastp检索、MMseqs2聚类、InterProScan注释和系统发育分析（GTDB-tk、RaxML-ng、FastTree）。

研究结果：
Purification and characterization of KsBfr：通过铵盐分级和羟基磷灰石层析两步纯化获得KsBfr；SDS-PAGE显示>250、约18和<15 kDa三条带，MALDI-ToF MS肽质量指纹识别三条带均为KSMBR1_0066，最强带约18 kDa。UV-Vis显示分离态Soret带411 nm、约550 nm宽峰，还原后Soret带移至423 nm并出现527和557 nm Q带（Q-bands），符合b型heme；280 nm吸收提示存在铁矿物核心（iron mineral core），按24个亚基和12个heme估算heme b浓度133 μM。负染TEM显示均一颗粒，外径14.3 ± 1 nm、核心6.1 ± 0.9 nm；DLS显示直径13.6 nm、多分散指数（PDI）0.03。

Iron loading of apo-KsBfr：制备apo-KsBfr后，分离态KsBfr在<330 nm吸收更高且自380 nm起陡增，apo-KsBfr自300 nm起升高，提示apo制备成功。逐步加入Fe²⁺后，apo-KsBfr首次加入即出现411、527和557 nm特征，提示heme还原；320 nm吸收升高提示铁装载；自第三次加入起基线升高，提示形成胶体铁氢氧化物（colloidal ferric hydrous oxide），Soret带下降。分离态KsBfr首次加入使heme部分还原，第二次加入即出现明显基线升高，可能因其已部分装载铁；无KsBfr对照和未加铁对照无显著光谱变化。

Distribution of bfr among anammox bacteria：对Brocadiales基因组进行检索显示，大多数基因组编码至少一个Bfr同源物（117/142，82%）；25个未检出候选者的基因组中12个属于Scalinduaceae。三个类群含两个候选bfr序列：除GCA_021646445.1外的所有Kuenenia、除GCA_020851875.1外的Brocadia一个进化支，以及Scalinduaceae内四个基因组的并系群。Brocadiales Bfr形成bfr1和bfr2两簇；bfr1仅含Brocadiaceae序列（包括KSMBR1_0230），bfr2含其他科及含两个同源物的Kuenenia和Brocadia序列（包括KSMBR1_0066），并与Mycobacterium tuberculosis H8F1Z2和Desulfovibrio desulfuricans Q93PP9聚类。多数Brocadiales数据库条目为永久草图，不能判定未检出同源物者是否真正缺失；FastTree非真正最大似然且未做bootstrap，bfr序列系统发育信号较低，需多 locus 分析确认。

讨论部分总结：讨论指出SDS-PAGE三条带均鉴定为KSMBR1_0066，Bfr外壳坚固，煮沸仅部分解离；最强约18 kDa符合单体大小，heme b为Bfr保守特征，颗粒尺寸与其他Bfr相符。由于分离的KsBfr为14 nm、电子亮外壳包围电子暗核心，而先前厌氧氨氧化体中颗粒为20 nm且完全电子暗，研究人员据此否定厌氧氨氧化体颗粒为Bfr的假说。大多数Brocadiales基因组含一个Bfr同源物，Kuenenia及Brocadia、Scalindua部分类群含两个；草图基因组限制判断，bfr1/bfr2聚类需多 locus 验证。Bfr被提出参与铁稳态与储存、heme合成与运输及氧/氧化应激保护；铁装载实验显示KsBfr能氧化铁，但基线升高和heme信号下降提示胶体铁氢氧化物及潜在氧自由基造成蛋白损伤，heme b在好氧搅拌10 min后仍部分还原，提示其与氧反应较慢，生理电子受体可能不是氧；Desulfovibrio等厌氧菌Bfr参与氧保护，KsBfr是否如此待研究。分离态KsBfr含电子暗核心且<330 nm吸收高于apo，提示铁矿物核心；天然纯化KsBfr含该核心支持其铁储存作用，对含大量heme蛋白的anammox细菌尤为重要；研究人员提出铁可从c型细胞色素和铁硫蛋白释放、运输并在胞质中再利用，KsBfr及anammox Bfr是否作为铁储存系统并介导heme生物合成/拆解值得研究。

研究结论（翻译）：研究人员从天然K. stuttgartiensis生物质中纯化获得KSMBR1_0066，其由宽14 nm的颗粒组成，具有6 nm电子致密核心。KSMBR1_0066单体大小为18 kDa，含heme b，并能将Fe²⁺氧化为Fe³⁺以实现内化。厌氧氨氧化物种的基因组分析显示，大多数基因组仅含一个Bfr同源物，而Kuenenia以及Brocadia和Scalindua的亚群编码两个Bfr同源物。研究人员提出，细菌铁蛋白在厌氧氨氧化细菌的铁储存中发挥重要作用，并可能在heme生物合成中铁的使用和再利用中具有潜在作用。