整合微生物组与代谢组学分析揭示腺瘤–结直肠癌序列中的菌群及代谢改变

《Microbiology Spectrum》：Integrated microbiome and metabolomic profiling reveals alterations across the adenoma–colorectal cancer sequence

　　

摘要
近年来，结直肠癌（colorectal cancer, CRC）在台湾的发病率不断上升，并与多种风险因素相关。越来越多的证据表明，肠道菌群失调（gut microbiota dysbiosis）促进CRC的发生发展。本研究旨在表征癌前及恶性结直肠病变中的微生物和代谢改变，并识别潜在的微生物相关生物标志物。研究人员纳入在台北荣民总医院接受结肠镜筛查或监测的个体，采用全长16S rRNA基因测序（full-length 16S rRNA gene sequencing）分析肠道微生物组成，以获得高分辨率的分类学图谱；基于微生物群落推断预测功能通路（predicted functional pathways），并进行靶向代谢组学分析（targeted metabolomic profiling）以评估微生物代谢产物。共纳入122例个体，包括62例健康对照、15例腺瘤（adenoma）和45例CRC。在对照、腺瘤和CRC组之间观察到微生物组成和预测功能通路的改变。与对照相关的分类群与碳水化合物发酵和氨基酸代谢通路相关，而与CRC相关的分类群，特别是梭杆菌属（Fusobacterium），与多种生物合成通路呈广泛负相关。代谢组学分析显示，CRC中牛磺熊去氧胆酸（tauro-ursocholanic acid）升高，而短链脂肪酸（short-chain fatty acids, SCFAs）降低。CRC相关细菌与SCFAs呈负相关，并与包括石胆酸（lithocholic acid）、猪胆酸（murocholic acid）、牛磺熊去氧胆酸和牛磺猪胆酸（taurohyocholic acid）在内的多种胆汁酸代谢物呈正相关。对全长16S rRNA测序、预测功能通路和代谢组学谱的整合分析，揭示了对照、腺瘤和CRC组之间的微生物和代谢差异。这些发现与肠道微生物改变和结直肠肿瘤形成之间的关联相一致，可为未来CRC微生物及代谢生物标志物的研究提供参考。

论文解读

一、研究背景与目的

结直肠癌（colorectal cancer, CRC）近年来在台湾已跃居发病率最高的恶性肿瘤。粪便隐血筛查联合结肠镜下癌前病变的检出与切除，已被证实可显著降低CRC的发病率和死亡率。然而，CRC发病率的持续上升仍与老龄化、肥胖、体力活动减少及饮食习惯等因素密切相关。在生活方式因素之外，CRC的发生发展还涉及遗传改变的逐渐积累，即经典的腺瘤–癌序列（adenoma–carcinoma sequence）。肠道菌群及其代谢产物被认为参与这一过程。肠道微生物通过维持上皮完整性、调节免疫应答和产生代谢产物等方式影响宿主健康；菌群失调则在结肠腺瘤和腺癌患者中已被反复观察到。例如，梭杆菌属（Fusobacterium）在CRC患者及癌前结直肠病变患者中丰度显著升高，变形菌门（Proteobacteria）也富集于CRC患者。短链脂肪酸（short-chain fatty acids, SCFAs）作为肠道细菌发酵非消化性碳水化合物、蛋白质和氨基酸的重要产物，在维持肠道屏障完整性、促进结肠上皮细胞分化与凋亡以及发挥抗炎作用方面具有关键功能。目前，基于全长16S rRNA基因测序和宏基因组方法，关于癌前结肠息肉和CRC患者相比健康个体肠道菌群改变尚未形成共识。本研究旨在通过全长16S rRNA基因测序和靶向代谢组学分析，系统刻画从对照、腺瘤到CRC序列中的粪便微生物组和代谢组改变，并识别与癌前及恶性结直肠病变相关的关键菌群或代谢物。

二、研究内容与主要结论

研究人员纳入2022年间在台北荣民总医院接受结肠镜筛查或监测的个体，共122例，包括62例健康对照（其中结肠镜确认对照Control_A 37例，独立健康对照Control_B 25例）、15例腺瘤和45例CRC（右半CRC_R 23例，左半CRC_L 22例）。通过全长16S rRNA基因测序、PICRUSt2功能预测和靶向粪便代谢组学分析，研究人员发现对照、腺瘤和CRC三组之间在微生物组成、预测功能通路和粪便代谢物水平上呈现协调一致的改变。对照相关菌群主要与碳水化合物发酵和氨基酸代谢通路相关，而CRC相关菌群特别是梭杆菌属与多种生物合成通路负相关，并与SCFAs降低及特定胆汁酸代谢物升高相关联。该研究为肠道微生物及其代谢改变与结直肠肿瘤发生之间的关联提供了进一步证据，也为未来基于微生物和代谢标志物的CRC早期诊断和预防策略研究奠定了基础。

三、主要技术方法

研究人员采用横断面研究设计，纳入来自台北荣民总医院结肠镜筛查或监测人群的粪便样本，并另设一组经严格健康筛查的粪便菌群移植供体作为独立对照。主要技术方法包括：使用PacBio Sequel System进行全长16S rRNA基因（V1–V9区）测序，产生高精度循环一致性序列（HiFi reads）；经DADA2去噪后采用QIIME2流程计算α多样性和β多样性，基于基因组分类数据库（GTDB, release v220）进行物种注释；应用PICRUSt2基于16S rRNA序列推断群落功能通路；采用超高效液相色谱-质谱法定量粪便SCFAs和胆汁酸；使用ANCOM-BC2进行差异丰度分析（校正年龄、BMI和性别），并通过稀疏偏最小二乘（sPLS）分析和Spearman相关分析整合微生物组与代谢组数据。

四、研究结果

1. 基线特征与肠型分布
三组间的年龄、BMI和血脂等指标存在显著差异，CRC组年龄较大、BMI较高。肠型（enterotype）分布在三组间显著不同（χ2 = 12.97，P = 0.011）：CRC组中拟杆菌属/粪球菌属（Bacteroides/Phocaeicola）肠型占62.2%，普雷沃菌属（Prevotella）肠型占26.7%，而腺瘤组（46.7%）和对照组（37.1%）相对富集厚壁菌门（Firmicutes）肠型。
2. α多样性与β多样性分析
α多样性指数（观察特征数、Faith系统发育多样性、Pielou均匀度和Shannon指数）在三组间总体无显著差异，仅Control_B与CRC_L、CRC_R与CRC_L之间在Faith PD上存在显著差异。基于Bray–Curtis距离的β多样性分析显示，三组间（R2 = 0.021，P < 0.001）和五亚组间（R2 = 0.041，P < 0.001）的群落组成均有显著差异；控制–CRC配对比较的PERMDISP不显著，提示该两组间群落组成的差异较为稳健。
3. 差异丰度分析
属水平上，Blautia、Alistipes和Anaerobutyricum在对照组富集，Control_B亚组相对丰度最高；Control_A相对富集考拉杆菌属（Phascolarctobacterium）和Dialister。CRC组显著富集梭杆菌属和副拟杆菌属（Parabacteroides）。种水平上，Fusobacterium A necrogenes、Fusobacterium animalis和Fusobacterium nucleatum J在CRC组显著高于对照组。ANCOM-BC2分析识别出Lawsonibacter sp900066825、Bacteroides luhongzhoulii、Ruminococcus B gnavus和Phocaeicola vulgatus在腺瘤中富集；而产丁酸菌Agathobacter rectalis和Faecalibacillus intestinalis在CRC中丰度较低。经年龄、BMI和性别校正后，仅Lawsonibacter sp900066825仍在腺瘤组显著富集。
4. 功能预测
PICRUSt2结合ANCOM-BC2分析显示，腺瘤组富集氨基酸代谢（苏氨酸分解、甲基乙二醛降解）和芳香族化合物降解（儿茶酚、原儿茶酸邻位裂解通路）相关预测通路；CRC组则富集能量代谢和细菌应激适应相关通路，如一氧化碳脱氢酶通路（CODH-PWY）、混合酸发酵和血红素生物合成II通路。对照相关菌属与碳水化合物发酵、中心代谢和氨基酸代谢通路正相关，而梭杆菌属与多种氨基酸生物合成、辅酶A生物合成和tRNA负载通路呈广泛负相关。
5. 代谢组学分析
共61份粪便样本纳入代谢组学分析。SCFA谱在三组间差异显著：甲酸、乙酸、丙酸和丁酸在CRC组中较对照组显著降低，腺瘤组介于两者之间；亚组分析显示腺瘤组的乙酸、丙酸、丁酸和甲酸均显著高于对照组和两个CRC亚组。胆汁酸谱中，牛磺熊去氧胆酸（tauro-ursocholanic acid）是区分度最高的代谢物，在CRC两个亚组中显著升高。梭杆菌属与多种SCFAs（丁酸、丙酸、甲酸、乙酸、戊酸等）负相关，与石胆酸、猪胆酸、牛磺熊去氧胆酸和牛磺猪胆酸等胆汁酸代谢物正相关；而对照相关菌属如Blautia、Alistipes、Dialister和Agathobacter与上述胆汁酸代谢物负相关。

五、讨论与结论

讨论部分指出，尽管总体群落多样性和微生物结构在组间差异有限，但特定菌群和预测代谢通路呈现显著的差异分布。Phocaeicola dorei、Anaerotignum faecicola、Negativibacillus massiliensis和Dysosmobacter segnis的丰度从对照到腺瘤和CRC呈递增趋势，提示可能与病变进展相关。腺瘤组中富集的通路主要涉及氨基酸代谢和发酵过程，而CRC组富集能量代谢和应激适应通路，反映了菌群对肿瘤相关肠道微环境变化的适应性代谢反应。代谢组学结果与功能预测一致，SCFAs从对照到腺瘤和CRC逐步降低，牛磺熊去氧胆酸在CRC中升高。研究局限性包括横断面设计无法确定因果关系、饮食和生活方式等混杂信息未系统记录、对照组代谢异质性以及PICRUSt2预测功能的局限性。结论认为，该研究基于全长16S rRNA测序鉴定出对照、腺瘤和CRC三组间肠道微生物组成、预测微生物功能和粪便代谢物的同步差异；对照相关菌群主要与碳水化合物发酵和氨基酸代谢通路相关，而CRC相关菌群特别是梭杆菌属表现出与生物合成活性降低、SCFAs水平下降和胆汁酸相关代谢物升高相关；这些观察提示微生物相关代谢特征与结直肠肿瘤发生之间存在潜在关联，但横断面设计限制了因果推断。该发现为未来基于微生物组和代谢物的CRC生物标志物及预防策略研究提供了依据。