《Microbiology Spectrum》：MSI-3, an improved version of the MSI application that includes both fungal and bacterial identifications for MALDI-ToF spectra
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基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-ToF MS）现已成为常规诊断的核心技术，能够实现微生物物种的精准鉴定。本研究评估了免费在线质谱鉴定平台（MSI）的最新版本MSI-3的性能，该版本现已支持细菌鉴定，并在原有真菌鉴定基础上进行了扩展。研究人员利用两
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-ToF MS）现已成为常规诊断的核心技术，能够实现微生物物种的精准鉴定。本研究评估了免费在线质谱鉴定平台（MSI）的最新版本MSI-3的性能，该版本现已支持细菌鉴定，并在原有真菌鉴定基础上进行了扩展。研究人员利用两个真菌数据集对MSI-3与MSI-2及Bruker MALDI Biotyper进行了基准测试：(i) 包含669株经测序菌株的参考面板（Panel 1），以及(ii) 一组由用户提交的真实世界光谱集（Panel 2）。在Panel 1的所有真菌类群中，MSI-3与MSI-2表现出等效性能，在物种或物种复合体水平上的一致性达到97.8%（均值892/912），并且相较于Bruker数据库，对丝状真菌的鉴定具有巨大增值效应（从约41%提升至约98%）。MSI-3的鉴定时间较MSI-2略有延长（每张光谱1.52秒对比0.84秒），但仍满足实时在线使用的需求。鉴定时间的增加被参考数据库规模的两倍扩充以及算法改进所抵消。在Panel 2中，MSI-3对细菌和酵母菌光谱的性能与Bruker相当，而在丝状真菌方面表现优于Bruker，尤其是曲霉属（Aspergillus spp.）、镰刀菌属（Fusarium spp.）和皮肤癣菌。MSI-3引入了一个新的“不可判读”（uninterpretable）类别，用于标记潜在混合或低质量光谱，从而便于结果解读。总体而言，MSI-3标志着MSI平台的重大进步，融合了灵活性、广泛的分类覆盖范围以及人工智能（AI）就绪特性。其与Bruker的联合使用增强了诊断性能，使MSI-3成为临床和研究环境中微生物鉴定的强大且可扩展的标准工具。
一、研究背景与目的
微生物的准确鉴定在临床微生物学、兽医实践和植物病理学中至关重要。传统方法如显微镜检查、生化试验和表型分析耗时长、易出错，尤其难以区分隐存种。分子生物学虽被视为金标准，但因成本高、技术复杂和处理时间长而限制了常规应用。自2010年代初引入临床实验室以来，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-ToF MS）已成为一种强大的替代方案，它基于独特的蛋白质图谱提供快速准确的鉴定，样品制备简单且易于集成到日常流程中。然而，商业数据库虽已广泛涵盖细菌和酵母菌，但对丝状真菌和皮肤癣菌仍不完善。为弥补这一空白，质谱鉴定（MSI）应用程序于2017年上线，旨在为医学生物学界提供基于特征明确的菌株构建的真菌MALDI-ToF MS参考数据库。2020年的更新（MSI-2）增强了对两大主流制造商光谱格式（Bruker和bioMérieux）的支持。鉴于原始数据库仅含单一细菌物种（大肠杆菌），为更好地满足用户需求并扩展实用性，研究人员将细菌参考图谱整合进核心MSI数据库，并彻底改进了鉴定算法以在处理更大数据库时保持快速处理能力。本研究旨在回答两个互补性问题：(i) 尽管参考数据库扩大且算法修改，MSI-3能否维持MSI-2先前对分子鉴定菌株的鉴定准确性；(ii) MSI-3在面对最终用户提交的光谱多样性时，在日常临床实践中表现如何？
二、关键技术方法
研究人员采用了两个独立的光谱测试面板进行验证。Panel 1包含来自已发表研究的4222张光谱，对应669株经特定DNA区域测序鉴定的分离株、912种生长培养条件和129个物种，这些光谱同时提交给MSI-2、MSI-3和Bruker真菌数据库（库版本2023，包含779个参考主光谱参数MSPs）进行鉴定。Panel 2则包含了2025年3月期间提交给MSI-2的45977张光谱，这些光谱均来自Bruker设备采集，并与Bruker RUO数据库和丝状真菌数据库进行比对，以模拟真实世界的常规使用场景。对于Panel 1，每种软件只保留每个分离株最高得分的鉴定结果，并与DNA测序结果比较，按物种水平、物种复合体水平、属水平一致、不一致和低于阈值进行分类。对于Panel 2，由于缺乏独立金标准，研究旨在量化MSI-3与Bruker之间的一致性，首先按微生物组别报告双方各自的鉴定数量，再对两者均有结果的谱图进行一致性分级分析。
三、研究结果
Panel 1：
经Fisher精确检验，MSI-2和MSI-3在所有真菌类群间均无显著差异。两种应用程序在物种复合体水平上与分子生物学的符合率约为98%，在物种水平约为88%，相比Bruker数据库（物种复合体水平仅41%，物种水平29%）提供了显著的增值效应。MSI-3引入了“不可判读”类别，当一张光谱与多个分类学上相距甚远的生物体产生显著匹配时发出警报，可能指示低质量光谱或混合培养物。
Panel 2 - 性能分析：
在32339张至少获得一次鉴定的光谱中，12086张为细菌。其中，非大肠杆菌的3261张细菌光谱中，74.4%被MSI-3和Bruker共同鉴定，20.6%仅被MSI-3鉴定，5%仅被Bruker鉴定。对于6444张酵母菌光谱，69%被双方共同鉴定，9.6%仅被Bruker鉴定，21.4%仅被MSI-3鉴定。对于13773张丝状真菌光谱，73.8%仅被MSI-3鉴定，23.8%被双方共同鉴定，仅2.4%仅被Bruker鉴定。在所有评估的真菌类群中，70%至87%的光谱仅被MSI-3而非Bruker鉴定。
Panel 2 - 一致性分析：
在18754张双方得分均高于阈值、类型一致且可判读的光谱中，99.5%在物种或物种复合体水平上表现出一致性。另有0.4%在属水平一致，0.1%的结果完全不一致。这19例不一致主要涉及细菌物种，当这些光谱提交给MSI-2时未获得鉴定结果，证实这些生物体未被收录在真菌数据库中。
四、讨论与结论
研究表明，MSI-3对丝状真菌的鉴定性能相对于Bruker真菌数据库具有显著增值效应，无论提交的真菌属种如何。虽然MSI-3的鉴定时间比MSI-2略有增加，但处理速度仍能满足常规在线使用。算法改进允许程序处理两倍的参考光谱而未损害鉴定过程。Panel 2的数据显示用户不仅提交真菌光谱也提交细菌光谱，因此MSI-3数据库纳入细菌参考提高了应用程序提供结果的准确性和完整性。与Bruker的比较应主要解读为鉴定系统间的一致性度量，而非直接的准确性评估。值得注意的是，Bruker对酵母菌的鉴定效率同样出色，这可能与大多数实验室采用直接点样法而MSI数据库主要基于全蛋白提取法开发有关。MSI-3的设计考虑了未来集成基于机器学习的人工智能（AI）模型的潜力，用于解决难鉴定或近缘类群的区分问题。“不可判读”类别的实施是一个有价值的改进，尤其适用于阴性质量控制。总体而言，最佳方法并非择一使用某个数据库，而是将两者结合，因为MSI-3中纳入数千条细菌参考并未损害鉴定性能，且处理时间仍适合在线鉴定。
研究结论翻译：
与MSI-2相比，MSI-3整合了更大的参考数据库，包括细菌光谱；引入了鉴定算法的轻微修改以在参考数量增加的情况下保持快速分析；并提供了新功能，例如“不可判读”类别，以帮助用户识别混合培养物或低质量光谱。这些发展使得MSI-3适用于经常同时分析细菌和真菌光谱的临床微生物学实验室的常规使用。MSI-3在细菌和酵母菌鉴定方面显示出与Bruker相当的性能，同时在丝状真菌方面明显优于Bruker，特别是对于曲霉属（Aspergillus）、镰刀菌属（Fusarium）和皮肤癣菌，这反映了MSI平台内精心策划的真菌参考数据库的丰富性。通过在单个应用程序中实现对细菌和真菌光谱的鉴定，MSI-3增加了常规使用中可被鉴定的光谱比例，同时保持了MSI-2之前取得的真菌鉴定性能。最后，MSI-3框架允许未来针对特定应用（如近缘物种鉴定或耐药性预测）实施专用AI模块。总体而言，MSI-3代表了MSI平台的重大演进，为常规微生物鉴定提供了一个实用且可扩展的解决方案，当与Bruker数据库结合使用时，进一步提高了所有主要临床相关微生物类群的鉴定性能。
