通过小麦突变体AHAS等位基因渐渗培育首例咪唑啉酮类除草剂抗性小黑麦

《Crops》：Development of the First Imidazolinone-Resistant Triticale Through Introgression of Mutant AHAS Alleles from Wheat

　　

在全球多样的农业生态环境中，小黑麦（triticale）具有经济竞争力强的籽粒产量、与小麦相当的高营养价值、对干旱和贫瘠土壤条件的耐受性以及对黑麦常见多种病害的抗性。尽管小黑麦的重要性日益增加，其生产主要依赖与小麦相似的农艺措施。然而，小黑麦对小麦常用多种除草剂的敏感性更高，使杂草管理复杂化，因此培育抗除草剂小黑麦品种成为促进该作物更广泛应用的重要机遇。本研究旨在通过将60Co伽马射线辐照产生的突变体小麦（Triticum aestivum）品系的抗性渐渗（introgression）至小黑麦，培育对咪唑啉酮类（imidazolinone）除草剂具有抗性的小黑麦品系。研究人员在分蘖期以推荐田间剂量的甲氧咪草烟–咪唑烟酸（imazamox–imazapyr）处理突变体小麦植株，以一株存活植株作为咪唑啉酮抗性来源。将该突变体与作为母本的小黑麦育种品系杂交，后代推进至F5代并以甲氧咪草烟–咪唑烟酸处理以确认抗性。该育种与选择过程最终获得稳定的5202和5195小黑麦品系。对AHAS基因的部分测序揭示两个品系均存在与甲氧咪草烟–咪唑烟酸抗性相关的Ser-653-Asn取代。等位基因特异性测序进一步揭示两个抗性品系间存在相反的AHAS序列特征，提示抗性等位基因在基因组分布上的差异。两个抗性小黑麦品系在苗前或苗后施用推荐田间剂量的甲氧咪草烟–咪唑烟酸时均能存活，但二者对除草剂的响应存在显著差异，其中5195品系始终表现出最高的抗性水平。这些发现凸显了诱发突变（induced mutagenesis）作为谷物育种新型农艺变异来源的价值。除直接促进杂草防除外，这些首批咪唑啉酮抗性小黑麦品系还可能在咪唑啉酮残留活性限制冬性谷类建植的轮作体系中提供重要的农艺优势。

论文解读

一、研究背景与目的

小黑麦（× Triticosecale Wittmack）是通过小麦与黑麦属间杂交培育的谷类作物，兼具小麦的籽粒品质与黑麦的抗逆特性，在全球多种农业生态系统中具有经济竞争力的产量表现。其营养价值高，赖氨酸和膳食纤维含量优于小麦，同时具有耐旱、耐贫瘠土壤以及抗多种病害等优良农艺性状。近年来，小黑麦作为覆盖作物在抑制杂草、减少土壤侵蚀和农业固碳方面的价值也受到关注。全球小黑麦年产量近二十年来平均约1400万吨，2024年达1240万吨。

尽管小黑麦重要性日益提升，其生产管理仍主要依赖与小麦相似的农艺措施。然而，小黑麦对小麦常用的多种除草剂表现出更高的敏感性，已有研究报道磺磺隆与2,4-D复配、部分苯氧羧酸类除草剂和取代脲类除草剂在不同施用量和施用时期下对小黑麦产生药害。与已开发出咪唑啉酮类等广谱除草剂抗性品种的小麦不同，UPOV PLUTO品种数据库中未记载任何咪唑啉酮抗性小黑麦品种。因此，培育抗除草剂小黑麦品种对于拓宽杂草管理手段、促进该作物在不同生产体系中的推广具有重要意义。

咪唑啉酮类除草剂通过抑制乙酰羟酸合酶（acetohydroxyacid synthase，AHAS；EC 2.2.1.6）——支链氨基酸生物合成中的关键酶——发挥除草作用。AHAS靶标位点的氨基酸取代可赋予对该类除草剂的抗性，并已在多种作物中成功用于培育咪唑啉酮抗性品种。在向日葵中，咪唑啉酮抗性杂交种的开发大幅扩展了苗后杂草管理选择，使广谱AHAS抑制型除草剂得以在该作物上选择性使用。类似策略对小黑麦可能同样具有重要价值——其杂草管理目前主要依赖为其他冬性谷类开发的除草剂，且作物敏感性可能限制其使用。咪唑啉酮抗性小麦种质的可用性为将该性状渐渗至小黑麦提供了机会。基于此，本研究旨在通过将伽马辐照诱导的突变体小麦品系的抗性渐渗至小黑麦，培育咪唑啉酮抗性小黑麦品系，并表征其除草剂响应及抗性的分子基础。

二、研究设计与关键技术方法

研究于2015至2025年间在阿根廷CEI Barrow试验站（38°19′16″ S，60°15′28″ W）开展。主要技术方法包括：

伽马射线诱变育种：以Nidera育种项目开发的六倍体面包小麦品种Baguette 10干种子为材料，采用⁶⁰Co伽马源以50、100和400 Gy剂量辐照。2016年生长季约25万株M₂代植株在免耕条件下建立，分蘖期以推荐田间剂量的甲氧咪草烟–咪唑烟酸（商品制剂Clearsol^? Plus，含3.3%甲氧咪草烟和1.5%咪唑烟酸，2 L ha^?1）处理，仅4株存活且全部来自400 Gy辐照种子。其中一株存活株PL104经两季繁殖后，其抗性后代330-PL104被选为抗性供体。

种间杂交与系谱选择：以抗性小麦品系330-PL104与CEI Barrow开发的六倍体小黑麦育种品系W18127T（母本）杂交，获得15粒F₁种子。F₁和F₂代在无除草剂选择压力下繁殖以允许遗传分离。F₃代在温室中以相同除草剂剂量处理45株，4株存活（PL1–PL4），其中PL2、PL3、PL4产生足够种子。经F₄、F₅代温室繁殖和2022年田间F₆代验证，最终依据除草剂抗性、穗部大小与育性、整体植株健康（尤其无条锈病症状）等标准选出5202（源自PL2）和5195（源自PL3）两个稳定品系。

分子表征：采用CTAB法提取基因组DNA，扩增AHAS基因含653位密码子的617 bp保守片段及含其他相关密码子的333 bp片段，双向测序后进行序列比对。进一步采用靶向Asn-653变体的等位基因特异性引物（N653）测序，与小麦6A、6B、6D染色体上已知AHAS位点序列进行诊断性核苷酸位点比较。

除草剂敏感性评价：苗前处理设0、2、4 L ha^?1三个剂量，21天后测定植株存活率与单株鲜重，采用双因素方差分析（ANOVA）和Tukey HSD检验。苗后处理设0至6 L ha^?1共9个剂量，采用非线性log-logistic模型拟合剂量–响应曲线，以额外平方和F检验比较曲线差异。田间产量试验于2025年生长季进行，每品系设6个5 m²小区，苗前施用推荐田间剂量，以双因素ANOVA分析产量数据。

三、研究结果

3.1 咪唑啉酮抗性机制的分子表征

对617 bp AHAS PCR产物进行部分测序，结果显示小黑麦植株间核苷酸序列高度一致。两个抗性品系（5202和5195）序列完全相同，与感病品种W18127T的一致性达99.84%。尽管序列高度相似，密码子653第二位核苷酸发生G-to-A转换，导致Ser-653-Asn氨基酸取代，该取代与甲氧咪草烟–咪唑烟酸抗性相关。扩增序列中未检测到其他非同义取代。等位基因特异性测序显示，5202品系的核苷酸特征主要与6B染色体上的AHAS位点一致，而5195品系的色谱图呈现对应6A和6B染色体AHAS位点的重叠信号。感病亲本W18127T的等位基因特异性测序无可检测信号。

3.2 苗前与苗后施用甲氧咪草烟–咪唑烟酸的敏感性评价

苗前施用甲氧咪草烟–咪唑烟酸完全抑制感病品种HB90的建植，少数出土植株在2和4 L ha^?1剂量下地上部鲜重仅为未处理对照的4%和1%。相比之下，苗前施用不影响抗性品系5202和5195的出苗，两个剂量下地上部生物量虽有轻微降低但与各自未处理对照无显著差异。

苗后施用时小黑麦的敏感性高于苗前。最低剂量0.5 L ha^?1即足以完全杀死感病品种HB90的全部植株，而两个抗性品系在该剂量下全部存活。基于植株存活率，5202和5195的I₅₀值分别为2.5和4 L ha^?1，差异显著。在推荐田间剂量2 L ha^?1下，5202存活率为80%，5195达100%。5195存活率仅在4 L ha^?1及以上剂量才出现明显下降。基于地上部鲜重的I₅₀值显示5195敏感性最低（1.4 L ha^?1），5202敏感性显著更高（0.9 L ha^?1），HB90的I₅₀低于最低测试剂量而无法可靠定量。

3.3 施用甲氧咪草烟–咪唑烟酸后抗性小黑麦品系的籽粒产量

田间条件下，苗前施用推荐田间剂量的甲氧咪草烟–咪唑烟酸对抗性品系5202和5195的籽粒产量无显著影响，而感病品种HB90受除草剂严重影响几乎不产籽粒。两个抗性品系在施药与未施药处理间的产量均无显著差异。未施药HB90的产量显著低于未施药5202，但与5195（施药或未施药）及施药5202无显著差异。

四、讨论与结论

本研究首次证明，面包小麦中诱导产生的咪唑啉酮抗性等位基因可通过常规杂交和选择成功转移至小黑麦，将此前仅在小麦、水稻、玉米、油菜、向日葵和高粱等作物中应用的技术拓展至小黑麦。分子表征证实抗性与AHAS Ser-653-Asn取代相关，且两个品系间抗性等位基因的基因组分布存在差异。尽管携带相同的靶标位点突变，两个抗性品系对甲氧咪草烟–咪唑烟酸的响应差异显著——5195始终表现出最高抗性水平，5202敏感性较高。这种差异提示Ser-653-Asn等位基因的表型表达可能受其基因组分布影响：5195的抗性变体存在于A和B基因组，而5202仅存在于B基因组。在多倍体小黑麦中，感病与抗病AHAS同源基因的相对贡献可能影响整体除草剂响应。但现有测序方法未物理分离各AHAS同源基因，抗性等位基因的基因组分布尚不能最终确定，需通过基因组特异性扩增或克隆测序加以验证，其他遗传或生理因素也不能排除。

抗性品系在苗前施用条件下比苗后表现出更高的耐受性，提示商业应用推荐中应考虑施用时期。田间条件下，推荐苗前剂量可完全控制感病小黑麦同时保持抗性品系籽粒产量，证明了该性状用于选择性杂草管理的实用价值。

除直接杂草防除外，咪唑啉酮抗性小黑麦在咪唑啉酮残留活性限制冬性谷类建植的轮作体系中具有重要农艺优势。咪唑啉酮类除草剂兼具广谱除草和残效活性，其药效常延续至处理后作物之外。在阿根廷，甲氧咪草烟加咪唑烟酸广泛用于咪唑啉酮抗性向日葵，当降雨不足以在播种前促进除草剂降解时，其残留可能伤害轮作的谷类作物。已有研究表明大麦、燕麦和小麦可能因咪唑啉酮残留而遭受建植、生物量和籽粒产量的大幅降低。本研究开发的抗性种质可使小黑麦在咪唑啉酮处理后的向日葵之后成功建植，从而大幅拓宽轮作选择。鉴于小黑麦可作为覆盖作物、冬季饲草、粮饲兼用作物或籽粒生产谷类的多功能性，这一特性对提高保护性耕作体系的灵活性、生产力和韧性具有重要价值。

最后，本研究凸显了诱发突变作为谷物育种新型农艺变异来源的价值。突变AHAS等位基因从小麦向小黑麦的成功转移证明，一个物种中产生的有益突变可有效渐渗至近缘作物，为扩大育种遗传资源、加速培育适应现代农业系统的改良品种提供了高效策略。这些结果为小黑麦育种提供了新种质，拓展了咪唑啉酮使用后选择性杂草管理和作物轮作的潜力。