《Colloids and Surfaces B: Biointerfaces》：Assessing the cytotoxicity of chemotherapeutic drug-free microparticles in osteosarcoma 3D spheroids
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•肿瘤细胞与基质细胞共培养形成了可重复的异型3D骨肉瘤模型•壳聚糖-铜/磷酸钙微粒对骨肉瘤球体具有细胞毒性•异型3D模型显示出比单一类型模型更高的耐药性引言在骨肿瘤中，骨肉瘤是最常见的原发性恶性骨肿瘤，主要影响10至25岁的儿童和年轻人，并与向肺部的快速全身转移相关[1]。标
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肿瘤细胞与基质细胞共培养形成了可重复的异型3D骨肉瘤模型
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壳聚糖-铜/磷酸钙微粒对骨肉瘤球体具有细胞毒性
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异型3D模型显示出比单一类型模型更高的耐药性
引言
在骨肿瘤中，骨肉瘤是最常见的原发性恶性骨肿瘤，主要影响10至25岁的儿童和年轻人，并与向肺部的快速全身转移相关[1]。标准治疗基于使用甲氨蝶呤、多柔比星和顺铂进行新辅助化疗，随后进行肿瘤切除[2]。尽管此类治疗提高了生存率，但已报道了化疗引起的肿瘤复发和心脏毒性[3]。大剂量静脉注射抗肿瘤药物及其严重副作用，使得开发智能药物递送系统（DDS）成为迫切需求，这些系统能在靶位局部给药，同时对健康组织影响最小[4]、[5]。
瘤内治疗提出将递送系统直接注射到肿瘤中的方法，可改善药物分布、延长肿瘤内药物保留时间，并减少正常组织对药物的摄取[6]。各种载药纳米载体，如脂质体、聚合物和无机纳米颗粒、胶束和外泌体，因改善了药物在靶组织中的蓄积而展现出治疗效果。尽管纳米制剂显示出临床潜力，但仍存在一些不足，包括被网状内皮系统快速清除以及在到达肿瘤部位前的药物泄漏[7]。与纳米级载体相比，微载体通过不同机制实现更缓慢且持续的药物释放，改善了肿瘤部位的药物保留，同时保护药物免受降解[8]。较大的尺寸有助于微粒保留在组织中，且相互作用保持细胞外特性，确保治疗药物集中在靶组织内，最大程度减少被周围健康细胞内吞[9]、[10]。具体应用于骨肿瘤治疗时，微载体的组成与自然骨组织相似，降解缓慢，可能在药物释放和治疗后支持骨愈合[11]、[12]。
评估药物或药物递送系统的抗癌活性需要涉及体外和动物模型，其中不同类型的肿瘤细胞2D和3D体外模型最常用作临床前模型。尽管动物模型能深入了解药物反应并提供体外模型所缺乏的血管化，但其在预测人类疾病机制方面的可靠性较差[13]。2D体外模型易于使用且经济实惠，但无法重现组织复杂的细胞-细胞相互作用和结构。这促使人们迫切需要设计更可靠、更具预测性的临床前模型，以用于药物筛选、药物开发和理解癌症生物学机制。异型3D细胞培养模型，如球体和类器官，旨在复制肿瘤微环境（TME）的复杂性和异质性[14]、[15]、[16]、[17]。为了模拟癌症的动态且复杂的微环境，已显著影响肿瘤发展和进展以及药物疗效的细胞成分（肿瘤细胞、基质细胞、免疫细胞、骨细胞、血管细胞）和非细胞成分（细胞外基质、生长因子）已被组合在3D模型中[18]。骨肉瘤-基质细胞共培养表明了基质细胞在肿瘤发展早期阶段的作用，通过表达基质金属蛋白酶（MMP-1和MMP-9），有助于重塑细胞外基质（ECM），为原发肿瘤的建立、肿瘤生长、侵袭和转移提供有利的微环境[19]。
最近，我们开发了复合微粒系统作为靶向骨癌治疗的药物递送载体[20]。制备的以壳聚糖-铜为基础并用磷酸钙（CaP）陶瓷修饰的微粒显示出作为多柔比星（DOX）载体的潜力，随着CaP数量的增加，载药能力更高。除药物和铜离子外，我们的结果表明CaP对骨肉瘤细胞的活力也有潜在影响。Cu(II)/Cu(I)氧化还原反应在铜氧化还原稳态和活性氧（ROS）形成中平衡的重要性已被充分记录，并提出利用这些反应抑制骨肿瘤生长[21]。另一方面，高浓度的细胞内钙离子已被证明可诱导细胞死亡，尽管高浓度的磷酸钙对骨形成至关重要[22]。尽管包括脂质体、胶束、金属、聚合物或陶瓷纳米颗粒在内的药物递送系统[23]作为潜在的创新发展而得到开发，但这些制剂仍可能引发化疗药物的某些副作用。因此，我们之前关于壳聚糖-Cu/CaP微粒的研究结果促使我们探索在不使用抗肿瘤药物的情况下，在更高CaP含量下的细胞毒性。
在此，我们评估了壳聚糖-铜/CaP微粒对培养的单一类型和异型骨肉瘤球体的细胞毒性，使用人骨肉瘤细胞（MG-63）和成人人皮肤成纤维细胞（HDFa）。首先，使用模型药物（DOX），通过改变肿瘤细胞与基质细胞的比例（2:1、1:1、1:2）来优化异型球体。使用0-10 μg/mL浓度范围的DOX来评估细胞类型比例对异型模型耐药性的影响，并与单一类型骨肉瘤球体进行比较。其次，选择对DOX最耐药的异型模型来验证复合微粒作为骨肿瘤治疗潜在可注射无化疗药物系统的抗癌活性。
分节摘要
材料
壳聚糖85/200（CHT，脱乙酰度为83.2%，制造商声明黏度为293 mPa·s）购自Heppe Medical Chitosan GmbH（德国萨勒哈尔）。醋酸铜(II)一水合物购自VWR International BDH Chemicals（比利时鲁汶）。乙酸（99%；HAc）、氢氧化钠（NaOH）和丙酮购自Lach-Ner, s. r. o.（捷克内拉托维采）。无水乙醇（EtOH）购自Gram-Mol d.o.o.（萨格勒布...
CHT-Cu/CaP微粒的制备与表征
化疗药物的传统静脉给药方式在癌症治疗中存在严重局限，包括肿瘤内药物浓度降低和全身毒性增加[24]。为克服这些局限，瘤内注射抗肿瘤药物微粒可能是一种潜在的替代方案。更进一步，注射不含化疗药物的微粒系统将能够实现低全身毒性并消除不良副作用...
结论
在本研究中，通过电喷雾法成功制备了用铜(II)离子离子交联并含有20 wt.% CaP的壳聚糖（CHT）基微粒。所得复合微粒（CHT-Cu/CaP）的平均直径范围为50至90 μm，呈现近乎完美的球形，圆形度因子接近1。扫描电子显微镜分析表明颗粒具有轻度粗糙的表面形态。进一步的结构...
资助
本研究由克罗地亚科学基金会资助[资助号 UIP-2020-02-6201]。
CRediT作者贡献声明
Anamarija Rogina：撰写-审稿与编辑、监督、资源、项目管理、方法论、资金获取、概念化。Leonard Bauer：撰写-审稿与编辑、形式分析、数据管理。Zoran Malba?a：调查研究、数据管理。Martina Omazi?：调查研究、数据管理。Cassandre Baudon：调查研究、数据管理。Andrea Lon?arevi? Vrabec：撰写-初稿、可视化、调查研究、数据管理、概念化。Iva Bazina：撰写-...
利益冲突声明
作者声明不存在已知的竞争性经济利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
致谢
A.L.V.感谢欧莱雅-联合国教科文组织"科学女性"2025项目。图形摘要使用BioRender创建。（2026）
Iva Bazina|Andrea Lon?arevi? Vrabec|Cassandre Baudon|Martina Omazi?|Zoran Malba?a|Leonard Bauer|Anamarija Rogina
