《Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases》：Bacterial diversity associated with Streblidae flies parasitizing cave-dwelling bats from northeastern Brazil
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蝙蝠（翼手目）是高度多样的哺乳动物，在生态系统中扮演关键角色，并携带多种微生物，然而其外寄生蝇的微生物组仍知之甚少。本研究利用16S rRNA基因测序技术，对来自巴西东北部洞穴蝙蝠种群的两个蝙蝠–外寄生蝇体系——大裸背蝠（Pteronotus gymnonot
蝙蝠（翼手目）是高度多样的哺乳动物，在生态系统中扮演关键角色，并携带多种微生物，然而其外寄生蝇的微生物组仍知之甚少。本研究利用16S rRNA基因测序技术，对来自巴西东北部洞穴蝙蝠种群的两个蝙蝠–外寄生蝇体系——大裸背蝠（Pteronotus gymnonotus）–约翰逊 Trichobius 蝇（Trichobius johnsonae）与吸血蝠（Desmodus rotundus）–寄生 Trichobius 蝇（Trichobius parasiticus）——所关联的细菌微生物组进行了表征与比较。共成功测序68份蝙蝠蝇样本，经质量过滤后保留67份用于后续生态学分析。细菌群落以γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）和α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）为主，其中 Arsenophonus、Bartonella 及未解析的内共生菌相关类群为最丰富的细菌类群。α-多样性模式因所考虑的指标而异：观测到的ASV丰富度受蝙蝠蝇物种、性别及其交互作用影响；Shannon多样性因蜱蝇物种和性别而异；Faith系统发育多样性则因蝙蝠蝇性别不同而存在差异。值得注意的是，雄性 T. johnsonae 的观测ASV丰富度高于雌性，而在 T. parasiticus 中未检测到显著的性别差异。β-多样性分析一致揭示了两个蝙蝠–外寄生蝇体系间细菌群落组成的差异，而性别的影响则具有体系依赖性：在基于系统发育信息的分析中，T. johnsonae 雄性与雌性之间存在显著分化，但 T. parasiticus 两性间未检测到显著差异。差异丰度分析进一步鉴定出 Romboutsia、Bartonella、Bacteroides 及一个未分类的假单胞菌门（Pseudomonadota）属为组间判别性类群。总体而言，这些发现揭示了两个蝙蝠–外寄生蝇体系间细菌多样性与组成模式的显著差异，并表明与性别相关的微生物组变异在蝙蝠蝇物种间并非一致。
研究背景与科学问题
蝙蝠（翼手目）是全球第二大哺乳动物类群，在生态系统中扮演授粉、种子传播和害虫控制等关键角色，同时也携带种类繁多的微生物，包括潜在致病菌。然而，相较于对蝙蝠自身微生物组的广泛研究，其体表外寄生生物——尤其是蜱蝇科（Streblidae）蝇类——所携带的细菌群落仍缺乏系统认知。蜱蝇是热带地区蝙蝠最常见的体外寄生虫，具有专性吸血、胎生繁殖及宿主特异性等生物学特性，其微生物组可能对蝇类生理、病原传播及蝙蝠种群健康具有潜在影响。目前，针对巴西蝙蝠蜱蝇微生物组的研究仅有少数报道，且多集中于特定生物群系，如塞拉多（Cerrado）和大西洋森林，而针对巴西东北部洞穴蝙蝠种群的研究尚属空白。此外，不同蝙蝠–外寄生蝇体系中细菌群落的结构差异及其与蝇类性别的关系仍未得到充分解析。基于此，研究人员开展本研究，旨在系统表征并比较两种蝙蝠–蜱蝇体系——大裸背蝠–约翰逊 Trichobius 蝇与吸血蝠–寄生 Trichobius 蝇——的细菌微生物组，验证两个假设：蜱蝇微生物组以γ-变形菌纲为主导，且两体系间细菌群落组成存在差异，并伴随蝇类性别相关的额外变异。
研究内容与主要结论
研究人员于2023年11月至2024年7月期间，从巴西东北部四个州的六个洞穴中采集了77只蜱蝇样本，隶属于上述两个蝙蝠–外寄生蝇体系。经形态学与分子鉴定后，68份样本成功扩增16S rRNA基因V3-V4高变区并进行高通量测序，最终67份样本纳入生态学分析。研究发现，细菌群落以γ-变形菌纲和α-变形菌纲为主，Arsenophonus、Bartonella 及未解析内共生菌相关类群为优势类群。α-多样性分析显示，观测ASV丰富度受蝇种、性别及其交互作用影响，雄性 T. johnsonae 的丰富度显著高于雌性，而 T. parasiticus 两性间无显著差异；Shannon多样性在 T. parasiticus 及雄性蝇中更高；Faith系统发育多样性仅在性别间存在差异，雄性高于雌性。β-多样性分析一致揭示两体系间细菌群落组成存在显著差异，且性别效应具有体系依赖性：T. johnsonae 两性间群落分化显著，而 T. parasiticus 两性间无显著差异。差异丰度分析鉴定出 Romboutsia、Bartonella、Bacteroides 及一个未分类假单胞菌门属为组间判别性类群，其中 Romboutsia 在 T. johnsonae 中富集，Bartonella 在 T. parasiticus 中丰度更高。这些发现表明，蝙蝠–外寄生蝇体系的微生物组分化涉及个体内多样性变化与群落组成改变，且性别相关的微生物组变异在蝇种间并非一致。
主要关键技术方法
本研究采用以下关键技术方法：基于16S rRNA基因V3-V4高变区扩增子的高通量测序（Illumina NovaSeq 6000平台，双端250 bp）；利用DADA2流程进行序列去噪、ASV推断与嵌合体去除，并以SILVA v138.2数据库进行物种注释；采用decontam基于流行率方法结合阴性对照（开放匀浆对照与封闭提取对照）进行背景污染序列筛查；基于最大似然法（GTR模型）构建ASV系统发育树；α-多样性采用广义线性混合模型（GLMM）评估蝇种、性别及其交互作用，以宿主蝙蝠个体为随机效应；β-多样性采用迭代子采样策略避免伪重复，结合PERMANOVA与PERMDISP分析；差异丰度分析采用MaAsLin3线性混合模型。样本来源于巴西东北部六个洞穴，涵盖Pernambuco、Ceará、Rio Grande do Norte和Sergipe四州。
研究结果
3.1 16S rRNA基因V3-V4高变区扩增：77份蜱蝇样本均成功扩增内源性 cox1 基因，其中68份（88.3%）成功扩增16S rRNA V3-V4区并进入测序，包括35份 T. parasiticus 和33份 T. johnsonae；另有5份阴性对照成功测序用于污染鉴定。
3.2 高通量测序与数据处理：73个文库（68份样本+5份阴性对照）共产出7,104,055对原始读段，经质量过滤、拼接、去噪及嵌合体去除后保留3,592,729条读段和10,240个ASV。经污染过滤去除2,536个ASV（含85个污染相关ASV和2,451个仅见于阴性对照的ASV），并排除1个极端离群样本（TJFM7，含1,439个ASV）后，最终数据集包含67份样本、6,282个ASV和2,885,858条读段。以31,686条读段为稀释阈值，17份样本保留原始深度，50份样本稀释至阈值。
3.3 多样性分析与微生物组成：α-多样性因指标而异——观测ASV丰富度受蝇种、性别及交互作用显著影响（T. johnsonae 雄性EMM=183.5显著高于雌性EMM=65.1，T. parasiticus 两性间无显著差异）；Shannon多样性在 T. parasiticus（EMM=3.76）高于 T. johnsonae（EMM=3.38），雄性（EMM=4.04）高于雌性（EMM=3.11）；Faith系统发育多样性仅性别间显著，雄性（EMM=36.59）高于雌性（EMM=16.42）。β-多样性方面，Bray-Curtis距离的PERMANOVA显示蝇种（R?2=0.167）和性别（R?2=0.072）均显著影响群落组成，交互作用呈边缘显著（p?=0.052）；加权UniFrac距离显示蝇种、性别及交互作用均显著，且 T. johnsonae 两性间群落差异显著而 T. parasiticus 两性间无显著差异。群落组成上，两蝇种均以γ-变形菌纲（54.16%和58.48%）和α-变形菌纲（14.01%和34.95%）为主；T. parasiticus 以 Arsenophonus（56.40%）、Bartonella（28.04%）和 Wolbachia（6.30%）为主，而 T. johnsonae 以未解析内共生菌相关类群（41.92%）、Bartonella（8.16%）和 Metamycoplasma（12.33%）为主。属级共享分析显示，T. johnsonae 体系含504个独有属（52.6%），T. parasiticus 体系含157个独有属（16.4%），两体系共享297个属（31.0%）。差异丰度分析鉴定出4个判别性属：Romboutsia 在 T. johnsonae 中一致富集（log?FC范围-6.19至-8.59），Bartonella 在 T. parasiticus 中丰度更高（log?FC=5.85和7.65）。
讨论与结论
讨论部分指出，γ-变形菌纲的优势地位与先前对蜱蝇微生物组的研究一致，Arsenophonus 和 Wolbachia 作为垂直传播的内共生菌反复出现，而 Bartonella 的检出从One Health视角具有重要公共卫生意义——近期实验研究已证实蜱蝇可作为蝙蝠间 Bartonella 的传播媒介。T. johnsonae 中未解析内共生菌相关类群的BLASTn分析显示其与 Trichobius yunkeri 中报道的细菌序列高度相似，但分类地位与共生状态仍未明确。研究局限性包括样本量有限、洞穴间样本分布不均衡导致无法纳入洞穴效应、以及16S rRNA基因数据无法确证共生关系等。结论部分总结：本研究揭示了两蝙蝠–外寄生蝇体系间细菌多样性与群落组成的显著差异，γ-变形菌纲总体占优，α-和β-多样性均随蝇种和性别变化，且性别效应具有体系依赖性——T. johnsonae 中性别差异显著而 T. parasiticus 中不明显。这些发现拓展了对蜱蝇相关微生物组的认知，强调了在研究蝙蝠–外寄生蝇体系微生物群落时需综合考虑外寄生蝇身份、性别、宿主关联及生态背景。未来需在更多宿主物种和环境中进行均衡采样，并结合功能与基因组学方法，以阐明这些细菌关联的生态角色及潜在流行病学意义。
