哺乳动物病原性卵菌*Pythium insidiosum*临床分离株近完整参考基因组组装报告

《Microbiology Resource Announcements》：Draft genome sequence of the mammalian pathogenic Pythium insidiosum

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摘要

所报道的基因组代表了哺乳动物病原性卵菌Pythium insidiosum的一个近乎完整的参考组装，该基因组来自美国南部动物身上采集的临床分离株。基因组组装是基于Oxford Nanopore Technologies和Illumina MiSeq平台获得的长读长和短读长测序数据的联合分析完成的。

公告

Pythium insidiosum可引起人类和动物的致命性疾病（1，2），且对抗真菌治疗反应不佳（1，3，4）。对哺乳动物分离株的基因组特征分析有助于理解毒力机制并改进诊断策略。来自得克萨斯州的一只狗（7011-1）以及佛罗里达州的一匹马和一只狗（111-60和111-70）的临床分离株被送往我们的诊断服务部门进行疑似卵菌感染的检测。原始样本在Columbia血琼脂（Thermo Fisher Scientific，美国）上于35°C培养48–72小时，在获得所有者同意后，使用剩余材料通过将菌丝体传代培养到新鲜的Columbia平板上获得纯培养物。使用Wizard Genomic DNA Purification Kit（Promega）按照制造商方案，分别收集每个分离株的菌丝体进行DNA提取。通过Qubit评估DNA浓度，通过NanoDrop和TapeStation评估质量。通过对DNA分离株的内部转录间隔区2（ITS）和大型亚基（28S）区域进行PCR扩增，确认了病原体的身份。结果经Sanger测序（Applied Biosystems，3730xl Genetic Analyzer），与GenBank中的Pythium insidiosum匹配度为100%（ITS）和99.90%（28S）（5）。短读长测序最初是为了使用分离株7011-1进行组装准确性验证而生成的。随后从佛罗里达分离株获得长读长，以提高连续性和更好地解析卵菌典型的基因组异质性。制备了2,332 ng基因组DNA的Illumina文库，用AMPure XP磁珠纯化，并在Illumina MiSeq（v2化学试剂，Illumina Inc.，加利福尼亚州圣地亚哥，美国）上进行测序，生成2 × 250 bp的双端读长。得到的152,949,22条原始读长使用Cutadapt（3.4）（6）进行质量修剪，并使用FastQC（v0.12.1）（7）进行评估。分离株111-60和111-70在GridION（R10.4.1流动槽，Oxford Nanopore Technologies [ONT]）上以400 bp模式独立测序。分离株111-70测序两次以增加总测序产量。使用ONT无PCR连接试剂盒（SQK-NBD114.96）和NEBNext Companion Module（E7180L）制备Nanopore文库。测序产生5,230,003条读长（N50 = 2,396 bp），包括111-60和111-70分离株的所有3个读长数据集。Dorado（v0.5.3）（8）使用超精确模型和5mC/5hmC检测进行碱基识别，并使用Samtools fastq（v1.20）（9）生成FASTQ文件。接头修剪在解复用过程中进行，测序质量统计使用fastQC（v0.23.4）（10）生成。在组装前使用Porechop（v0.2.4）（11）过滤低质量碱基。将干净的ONT读长合并并使用Flye v2.9.3（12）进行de novo组装。所得组装使用Medaka v2.0（13）利用ONT读长进行抛光，随后使用来自7011-1的Illumina读长进行两轮Pilon（14）抛光优化，以提高连续性和碱基水平准确性（15，16）。基因组注释使用以下软件完成：Funannotate（v1.8.17）（17）配合Augustus（Toxoplasma gondii）（18）、InterPro（iprscan/5.75–106.0）（19）、eMapper（eggnog-mapper/2.1.12）（20）、QUAST（v5.3.0）（21）和BUSCO（v5.8.3，eukaryota_odb10）（22）。使用BUSCO评估基因组完整性，基于保守单拷贝直系同源基因的回收率估计为91.4%。基因组组装和注释的详细统计汇总于表1。

表1

表1Pythium insidiosum基因组组装和注释的汇总统计

特征	数值
总组装长度（Mb）	43.4
支架数量	1,219
重叠群数量（≥1,000 bp）	1,067
重叠群数量（≥5,000 bp）	640
重叠群数量（≥10,000 bp）	498
最长重叠群	793,719
N50（bp）	177,225
L50	70
BUSCO组总数	255
完整BUSCO数量（%）	91.4%
完整单拷贝BUSCO数量（%）	90.2%
重复单拷贝BUSCO数量（%）	1.2%
不完整BUSCO数量（%）	1.6%
缺失BUSCO数量（%）	7.1%
%GC	58
预测蛋白编码基因总数	13,947
NCBI BioProject登录号	PRJNA1334412
GenBank组装登录号	JBVVWS000000000

致谢

我们感谢佛罗里达大学兽医学院临床微生物学实验室的Lisa Glick女士；佛罗里达大学兽医学院小动物临床科学系的Lopa Kher博士；以及佛罗里达大学兽医学院大动物临床科学系的Diego de Gasperi博士为本项目提供临床样本分离株。