苏黎世湖八株培养鱼腥藻的高连续性混合测序基因组组装

《Microbiology Resource Announcements》：Hybrid sequencing recovers highly contiguous genome assemblies from eight cultured Planktothrix rubescens isolates from Lake Zurich

　　

摘要

我们报告了从瑞士苏黎世湖分离的八株培养鱼腥藻 (Planktothrix rubescens) 的高连续性基因组组装结果。Illumina 和 Nanopore 混合测序产生了高质量、近乎完整、近乎无污染的组装结果，其中包括七个单连续体基因组，四个被标记为环状。

公告

Planktothrix rubescens 是一种丝状淡水蓝细菌，可产生微囊藻毒素，这是一种强效肝毒素，威胁作为饮用水源和休闲场所的湖泊 (1)。在苏黎世湖等寡中营养湖泊中，适应低光的 P. rubescens 可以在温跃层形成密集群体，这使得完整的参考基因组对于研究毒素生物合成、菌株多样性和生态适应具有重要价值 (2)。

测序菌株包括无菌参考菌株 A7 (3)，由 A. E. Walsby 于 1993 年从苏黎世湖分离，以及七株非无菌分离株。后者于 2018 年 5 月至 6 月通过浮游生物网在 0–15 米深处采样获得（47°18′16″N, 8°34′31″E），使用玻璃微吸管进行单丝挑选，通过三滴无菌过滤（0.2 μm）湖水洗涤，并重新接种到蓝藻培养基 (4) 中。培养物在实验室条件下维持（~6 μmol 光子 m^?2 s^?1，18°C），并在提取 DNA 前大约每 6 周转移到新鲜培养基中。对于每种培养物，25 毫升被过滤到 5 μm 聚碳酸酯膜上（Nuclepore Track-Etch Membrane, 47 mm; Whatman）。含有菌丝的过滤片被转移到 1× PBS 中并在 80°C 下加热 6 分钟。DNA 提取遵循一种改进的方案，其中包含了 METIS 步骤，该步骤专为从蓝细菌中提取高分子量 DNA 而开发 (5)。简而言之，热处理样品用胰蛋白酶 K、十二烷基硫酸钠（SDS）和溶菌酶处理。裂解液通过逐步离心澄清，并在异丙醇中沉淀 DNA。在沉淀过程中，反复去除并替换含有色素黏液的分数，直到溶液澄清且 DNA 可见。DNA 被沉淀，重悬于无核酸酶水中，并使用 AMPure XP 磁珠（Beckman Coulter）纯化。文库制备和多重连接使用未经修改的 Illumina TruSeq DNA Nano kit 以及 Oxford Nanopore Ligation Sequencing gDNA Native Barcoding Kit (SQK-NBD114.24)，ONT 文库不进行 DNA 打断或大小选择。文库在 Illumina NovaSeq 6000 平台（2 × 150 bp; FGCZ, 苏黎世）和 Oxford Nanopore MinION Mk1D 上使用 R10 FLO-MIN114 流通池测序（Limnological Station, 苏黎世）。Nanopore 读数使用 Dorado v7.11.2 (Oxford Nanopore Technologies) 及其超准确模型 v5.5.0 进行碱基调用、去多重化和接头修剪。Illumina 读数使用 BBMap v39.26 (6) 中的 BBDuk 进行质量修剪 (qtrim=rl trimq=18) 并筛选质粒和适配器 (k=21)，而 Nanopore 读数使用 Chopper v0.7.0 (7) (-q 10 -l 500) 过滤并使用 Porechop_ABI v0.5.1 (8) 修剪适配器。每个菌株的测序生成了中位数为 16.3 Gb 的 Illumina 短读数数据和 0.67 Gb 的 Nanopore 长读数数据（中位数 N50: 7.18 kb）。使用 BBMap v39 (6) (kfilter = 31, subfilter = 15, maxindel = 80) 将 Illumina 读数比对到 75 个公开可用的 Planktothrix 基因组上，并使用 minimap2 v2.28 (9) (-x map-ont) 将 Nanopore 读数比对到这些基因组上。丢弃未比对的读数，保留每个菌株中位数为 12.9 Gb 的 Illumina 数据 (Q39) 和 0.23 Gb 的 Nanopore 数据 (Q19; N50, 11.7 kb) 用于混合组装。使用 Unicycler v0.4.8 (10) 生成混合组装，并通过根据 CheckM2 v1.0.2 (11) 估算进行迭代移除短连续体进行手动策划，在保留完整性的同时减少污染。Illumina 读数计数通过 FastQC v0.11.9 (12) 获得，而 Nanopore 读数计数和读数 N50 值通过 NanoStat v1.6.0 (13) 计算。GC 含量、CDS、rRNA 和 tRNA 计数从 Prokka v1.14.6 (14) 注释中提取。除非另有说明，否则使用默认参数。

七个组装结果为单连续体，包括四个闭合环状基因组；一个仍保持为四个连续体 (表 1)。该基因组集合为研究 P. rubescens 中的毒素生物合成、菌株多样性和生态适应提供了有价值的资源。

表 1

表 1 Planktothrix rubescens 苏黎世湖菌株^a

菌株	登录号	环状	连续体数 (n)	完整性 (%)	污染率 (%)	大小 (Mb)	CDS (n)	5S (n)	16S (n)	23S (n)	tRNA (n)	GC (%)	读数 (n)	ONT N50 (bp)
ZS_A7	GCA_984783665	是	1	99.98	0.00	5.40	4819	3	4	4	42	39.48	120,873,822 (Ill.) 11,270 (ONT)	20,465
ZS_3A4	GCA_984783925	是	1	99.99	0.03	5.43	4835	3	4	4	42	39.51	25,939,422 (Ill.) 50,642 (ONT)	9,156
ZS_3C4	GCA_984783935	是	1	99.97	0.00	5.43	4845	3	4	4	42	39.50	80,018,090 (Ill.) 133,352 (ONT)	5,595
ZS_4B4	GCA_984783585	是	1	99.95	0.00	5.42	4807	3	4	4	42	39.48	69,766,194 (Ill.) 42,581 (ONT)	6,496
ZS_3C1	GCA_984783895	否	1	99.99	0.01	5.40	4821	3	4	4	42	39.51	97,384,004 (Ill.) 7,557 (ONT)	14,857
ZS_5C5	GCA_984783575	否	1	99.95	0.00	5.38	4799	3	4	4	42	39.50	106,501,368 (Ill.) 15,444 (ONT)	14,180
ZS_5C6	GCA_984783635	否	1	99.95	0.00	5.49	4872	3	4	4	42	39.52	70,047,462 (Ill.) 37'301 (ONT)	7,156
ZS_4D3	GCA_984783605	否	4	99.98	0.01	5.42	4831	3	4	4	42	39.51	92,604,192 (Ill.) 16,634 (ONT)	18,218

^a

Circ.，环状；Ctgs.，连续体；Comp.，完整性；Cont.，污染；Ill.，Illumina。

致谢

我们感谢 Daniel Marty 和 Barbara Bassin 对培养物的精心维护。

本研究由瑞士国家科学基金会支持（资助号 10000877, 320030-231356, 193240）。