《Current Research in Food Science》：Integrated Machine Learning and In Vitro Pipeline for TRPA1-Active Chemesthetic Flavor Compounds: From Predictive Screening to Molecular Mechanisms
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化学感觉（chemesthesis）构成食品感官感知的一个基本维度，由瞬时受体电位锚蛋白1（transient receptor potential ankyrin 1，TRPA1）离子通道触发，该通道介导对辛辣和刺激性风味化合物的响应。然而，对风味化合物激活
化学感觉（chemesthesis）构成食品感官感知的一个基本维度，由瞬时受体电位锚蛋白1（transient receptor potential ankyrin 1，TRPA1）离子通道触发，该通道介导对辛辣和刺激性风味化合物的响应。然而，对风味化合物激活TRPA1的高效预测仍受限于传统实验筛选的低通量。在此，研究人员开发了一种整合计算和体外（in vitro）的筛选管道以克服这一限制。利用优化的随机森林（Random Forest，RF）机器学习模型，研究人员成功地预测并筛选出代表性风味化合物。研究人员利用新构建的TRPA1细胞系对这些预测进行了实验验证，钙流实验（calcium flux assay）证实所选候选化合物可引起剂量依赖性的通道激活。此外，分子对接和分子动力学模拟在原子水平上阐明了激活机制，并鉴定了关键相互作用残基。这一多学科框架能够实现对感觉受体配体的高效靶向筛选，并为风味驱动的化学感觉感知提供深入的分子见解。
风味感知是一种典型的多模态感官体验，远非传统味觉与嗅觉的简单叠加。其中，由三叉神经系统介导的化学感觉（chemesthesis）负责将食品中的特定化学成分转化为刺痛、灼烧、清凉或麻木等物理感觉。瞬时受体电位锚蛋白1（transient receptor potential ankyrin 1，TRPA1）离子通道因其对多种刺激性化合物的高敏感性，成为化学感觉感知中的关键分子枢纽，可被多种植物源防御性化合物激活，介导刺激和灼烧感，并在清凉感及复杂热风味感知中发挥独特调控作用。然而，发现新型TRPA1风味配体仍面临显著挑战：TRPA1通道配体多样性极高，其N端存在多个亲电半胱氨酸和赖氨酸残基，许多激动剂通过共价修饰而非经典“锁钥模型”激活通道，非亲电激动剂则可通过非共价结合诱导钙离子（Ca
2+）内流，使得基于固定结合口袋的传统分子对接难以准确预测；同时，TRPA1激活常伴随疼痛或不适，人体感官实验受严格伦理约束，并且个体间化学感觉敏感性差异大，难以建立统一标准。因此，亟需开发高效、准确的TRPA1配体筛选平台。机器学习（Machine Learning，ML）与计算化学的融合为配体筛选提供了新范式，能够从大规模化合物库中快速识别潜在活性分子，并揭示分子结构与感官属性之间的深层非线性关系。
针对上述技术瓶颈，本研究旨在建立一套整合计算预测与体外实验验证的高效多学科筛选管道，以加速新型TRPA1激活风味化合物的定向发现。研究人员比较多种机器学习算法后选择随机森林（Random Forest，RF）模型进行虚拟筛选；通过构建稳定表达hTRPA1的异源细胞系，利用钙流实验验证预测候选化合物的生物活性；结合分子对接和分子动力学（Molecular Dynamics，MD）模拟在原子水平上解析配体-受体相互作用模式与动态稳定性，阐明激活机制。该研究不仅建立了TRPA1激活风味化合物的高效筛选方法，也为食品科学中复杂感觉受体配体的发现与机制解析提供了具有转化潜力的研究框架。
关键技术方法方面，研究人员从公共生物活性数据库ChEMBL获取TRPA1激动剂与非活性化合物数据集，使用RDKit对SMILES字符串进行标准化处理，包括去盐、统一质子化状态和标准化互变异构体，并采用两阶段去重策略消除标签冲突；生成2048位Morgan拓扑指纹用于分子表征。比较了随机森林（RF）、支持向量机（SVM）、梯度提升分类器（GBC）、逻辑回归（LR）和k近邻（k-NN）五种算法，采用分层五折交叉验证和综合多指标评估框架评价模型性能。体外验证中，hTRPA1异源表达细胞和HEK293T细胞均来自General Biol，通过Western blot、实时荧光定量PCR和免疫荧光染色验证TRPA1表达；钙流实验采用FLIPR Calcium 6染料在FLIPR仪器上检测荧光信号变化。分子对接使用AutoDock Vina，以人TRPA1冷冻电镜结构（PDB ID: 6v9v）为受体模型；MD模拟使用GROMACS 2023，分别采用CHARMM36和GAFF2力场描述蛋白和配体，嵌入POPC磷脂双分子层，TIP3P水模型，0.15 M NaCl，310 K下进行100 ns模拟；通过均方根偏差（RMSD）、均方根波动（RMSF）、回旋半径（Rg）和氢键数目变化评估复合物稳定性。统计采用单因素方差分析（ANOVA）和Tukey事后检验。
3.1 机器学习模型构建与性能评估：通过比较五种机器学习算法的五折交叉验证ROC曲线，所有模型均表现出良好的分类能力，AUC值显著高于随机分类；RF模型在多指标上表现均衡，AUC为0.94 ± 0.03，准确率、F1分数和召回率均保持较高水平且95%置信区间稳定，表明其泛化能力和鲁棒性最佳。预测概率分布显示真正TRPA1激动剂的预测分数集中于高分段，非活性化合物集中于低分段；早期富集曲线显示RF模型在测试集上的EF
5%约为1.9，显著优于随机筛选基线。基于Tanimoto相似性的层次聚类揭示了数据集的结构多样性和局部聚集特征，证实模型是在较广化学空间中学习活性相关结构模式。
3.2 TRPA1激动剂与非活性化合物具有可区分的化学空间特征：t-SNE降维显示两类化合物在化学空间上部分重叠并存在多个相对富集区域；理化性质比较显示激动剂与非活性化合物在分子量、脂水分配系数（LogP）和拓扑极性表面积（TPSA）方面存在显著差异，激动剂分子量分布较低、疏水性和极性表面积具有独特范围。活性骨架分布显示无环骨架占比最高（约24.76%），苯环和二苯并氮杂卓衍生物骨架分别占14.29%和9.05%。基于RF模型预测评分与适用域置信度，结合骨架分布和研究需求，最终筛选出香草醛、丁香酚、百里香酚、乙酸、乳酸和柠檬酸作为候选风味化合物进行实验验证。
3.3 构建并验证hTRPA1异源稳定表达细胞模型：通过重组慢病毒将hTRPA1基因导入HEK293T细胞，经抗生素筛选获得稳定转导细胞群，未转导细胞在筛选过程中死亡，稳定转导细胞呈现明显绿色荧光蛋白（GFP）信号。Western blot检测到约130 kDa的TRPA1蛋白条带，显著高于野生型HEK293T细胞；免疫荧光结果显示GFP绿色信号与TRPA1红色荧光信号在细胞区域共定位，而未转导HEK293T细胞几乎无特异性TRPA1荧光信号，证明该异源表达细胞模型可成功用于TRPA1激动剂活性评价。
3.4 候选风味化合物对hTRPA1的剂量依赖性激活：钙流实验结果显示，香草醛、丁香酚和百里香酚在hTRPA1-HEK293T细胞中均诱导显著的剂量依赖性荧光响应，而未转导HEK293T细胞响应较弱或接近背景水平；香草醛的半数有效浓度（EC
50）为24.11 μM，丁香酚为22.42 μM且最大响应强度高于香草醛，百里香酚为49.02 μM。三种有机酸在pH 7.4至5.0梯度下呈现pH依赖性激活特征：乙酸和乳酸在pH 6.5–6.0范围内出现特异性激活信号，柠檬酸的特异性信噪比窗口相对较窄，可能因其作为三羧酸在未解离状态下跨膜速率慢于单羧酸，导致胞内酸化过程减缓。上述结果表明RF模型可有效识别具有TRPA1激活潜力的风味化合物。
3.5 分子对接揭示候选化合物与TRPA1的潜在相互作用模式：分子对接结果表明，不同候选化合物可定位于TRPA1蛋白的不同局部结合区域，通过氢键、C-H键、范德华力、烷基和π-烷基等非共价相互作用稳定配体-受体复合物。香草醛主要与Leu609、Phe612、His614、Cys621、Ile623、Thr624、Lys661、Tyr662、Gln664、Cys665、Pro666、Phe669、Tyr680和Thr684等残基相互作用；丁香酚结合区域涉及Ala718、His719、Met720、Asn722、Arg852、Leu982、Leu986、Lys989、Leu990和Pro991等残基；百里香酚主要与Phe884、Leu936、Ala939、Gln940、Ser943和Phe947等残基相互作用。酸性化合物更依赖极性和氢键网络：乙酸与Tyr918、Arg919、Glu920和Asn917等残基作用，乳酸与Asp915、Asn917、Tyr918、Arg919和Glu920等作用，柠檬酸凭借多个羧基和羟基可与Lys787、Gln791、Gln795、Arg852、Ser985和Lys989等残基形成多点氢键或静电相互作用。
3.6 分子动力学模拟支持配体-TRPA1复合物的动态稳定性：100 ns MD模拟结果显示，各配体-TRPA1复合物在模拟早期经历快速构象调整后趋于稳定，RMSD主波动范围约为0.4–0.6 nm，未发生显著解离或结构破坏；RMSF分析显示不同残基区域柔性差异明显，部分残基片段可能参与配体结合后的局部构象调整；Rg总体维持在4.55–4.70 nm，表明蛋白质整体紧密度未发生显著改变。氢键分析显示，酸性化合物尤其是乳酸和柠檬酸在模拟中形成较多瞬时氢键，而香草醛、丁香酚和百里香酚形成的氢键较少，提示芳香族配体的稳定结合可能更依赖疏水作用、芳香相互作用和范德华力。
总结讨论部分，研究人员指出TRPA1激动剂与非活性化合物在理化性质上的差异具有生物物理合理性，但仅凭这些性质不足以完全解释活性差异，需结合特定官能团、空间构象及受体结合模式进行综合判断；RF模型预测与体外钙流实验结果高度一致，说明该模型能够有效富集活性化合物并用于候选分子优先排序；分子对接与MD模拟共同支持不同结构类型风味配体通过差异化相互作用模式与TRPA1稳定结合，其中酸性化合物的pH依赖性激活特征与其跨膜速率和胞内酸化过程密切相关。该研究将虚拟筛选与实验验证闭环结合，有效克服了传统盲目筛选的局限。
研究结论部分翻译如下：综上，本研究成功建立了一种整合机器学习、体外细胞实验和计算化学的高效闭环筛选框架，用于鉴定靶向TRPA1的风味配体。随机森林算法在从复杂化学数据集中识别潜在TRPA1激动剂方面表现出卓越的预测性能。利用所建立的TRPA1异源表达系统，通过钙流实验严格验证了计算预测配体的生物活性。随后的分子对接和分子动力学模拟提供了机制层面的见解，确认了稳定相互作用并阐明了TRPA1离子通道口袋内的动态结合模式。这种将虚拟筛选与实验验证相结合的方法有效克服了传统盲目筛选方法的局限性。这些发现为未来高通量定向风味设计和感觉受体研究奠定了坚实基础。
