过继细胞疗法从实验台到临床转化的实用指南：案例系列

《Cytotherapy》：Practical Guide for Bench-to-Bedside Translation of Adoptive Cell Therapies: A Case-Based Series

　　

摘要

过继性细胞疗法（涵盖嵌合抗原受体（CAR）T细胞、病毒特异性T细胞以及其他工程化和非工程化细胞产品）的领域正在血液系统恶性肿瘤、实体瘤及其他临床适应症的广泛范围内快速扩展。一种过继性细胞疗法从概念走向临床，需要在每一个阶段——从临床前发现与验证，到生产、质量控制、监管监督，直至支持新药申请（IND）——都进行多学科专家的协调配合。最终，这些努力汇聚为安全有效地将细胞疗法交付给患者。在本综述中，我们探讨了将新型过继性细胞疗法产品从实验室推向临床的关键路径、挑战与考量。

引言

过继性细胞疗法（ACT），包括嵌合抗原受体（CAR）T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞及其他基因工程或非工程化细胞产品，是新兴的治疗模式，在广泛的临床适应症中展现出显著的前景。[1] 然而，ACT的研发与监管审批与传统小分子药物存在显著差异，因为其针对患者的个体化、基于细胞的特性引入了固有的生物学变异以及在研发、生产、监管审批、质量控制和临床实施中的独特挑战。

从化学、生产和控制（CMC）的角度来看，这些产品通常在学术机构或医院设施中以小批量形式生产，在早期研究者发起的试验中，往往作为单患者生产批次。这种分散化和个体化的方法需要创新的研究设计和有效的IND使能策略，并辅以灵活的生产与质量体系，以支持临床转化。

与此同时，ACT的快速扩展使得越来越多的学术中心寻求开发和开展早期细胞疗法试验。虽然这一扩展加速了创新，但也暴露了在缺乏既定框架的情况下应对复杂且不断演变的监管、生产和临床需求的专长差距。鉴于目前仍处于相对早期阶段，仍需要切实可行的指导来支持研究者将新疗法从实验室推向临床。

在本稿件中，我们重点强调了帮助研究者应对新型早期细胞疗法试验实施中监管要求的关键考量。我们采用基于案例的方法，阐述了与过继性细胞疗法首次人体I期临床试验开发相关的关键临床前、CMC和临床考量。具体而言，我们重点介绍了三个临床案例：（1）靶向诺如病毒NS6和VP1抗原的异基因诺如病毒特异性T细胞（NST），（2）CAR T细胞疗法在中枢神经系统（CNS）肿瘤中的新型递送方法，以及（3）靶向B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）新抗原的首次人体CAR T细胞试验。尽管这些案例研究是在美国监管框架下开发的，并主要反映FDA的考量，但其底层科学和基于风险的原则在国际上具有广泛的适用性。在美国以外地区的应用应考虑特定司法管辖区的监管要求。

IND由若干部分组成，共同支持临床试验的启动，包括临床前数据、CMC以及临床方案和研究者信息。这些部分共同构成了支持在临床试验中安全使用试验产品的框架。在本综述中，我们聚焦于这三个核心领域——临床前、CMC和临床——并通过代表性案例说明其应用。

临床前研究为临床试验开发提供了科学依据，并涉及CMC和临床方面的考量以确保患者安全（图1）。新型ACT的临床转化需要强有力的概念验证研究，证明其生物活性、安全性和临床测试的可行性。在此临床前阶段，体外和体内研究通过揭示驱动治疗反应的机制，为临床转化奠定基础，并帮助研究者了解治疗的安全性、耐受性和潜在疗效。

CMC部分概述了过继性细胞疗法的生产环境[2]和工艺、质量控制、放行检测、药品稳定性以及给药前准备。如果产品终点指标未达标或生产失败，应描述风险缓解计划。CMC开发的关键组成部分是建立关键质量属性（CQAs），即用于评估细胞产品身份、效价、纯度和安全性的可测量特征。这些属性指导产品表征工作，为质量控制和放行检测策略的开发提供信息，是确定可比性时的关键组成部分。虽然许多CQA被纳入放行标准，但一些可能主要用于产品表征或工艺理解，不要求用于产品放行。最终冻存产品的稳定性和解冻后细胞活力是CMC的重要组成部分，计划中应定义具体的时间点及相关检测参数。目前的细胞生产和递送策略因机构、具体的ACT产品以及机构标准操作规程而异。标准化的生产和递送方法，结合CQA的全面表征，将有助于有前景的ACT从单中心早期研究扩展到多中心II期和III期试验。[3]

临床部分包括研究方案，该方案定义了试验目的、纳入/排除标准、剂量和给药途径，并纳入相关监管要素以及安全性、监测和报告参数，以促进试验产品的前瞻性检测。I期首次人体研究的独特考量包括以安全性和耐受性为重点的剂量探索，并要求在儿科患者中评估直接获益的可能性。[4] 由于可能基于患者群体和ACT产品存在独特的毒性谱，需要多学科毒性缓解策略，确保安全的剂量递增对于I期试验规划至关重要。必须建立明确的不良事件报告标准、停药规则和剂量递减规则，以适用于临床试验的剂量递增和扩展阶段，这对于试验的安全实施和I期试验的监管监督是必要的。除方案设计外，ACT试验的成功实施需要由具备实验室、生产、临床和监管领域专长的多学科团队组成。与ACT转化路径各环节相关的美国食品药品监督管理局（FDA）主要指导原则总结于表1。后续表格提供了更多关于CMC（表2）、临床前（表3）和临床考量（表4）的具体信息。

人诺如病毒（HuNoV）是全球范围内流行性病毒性胃肠炎的最常见病因[5]，慢性HuNoV感染是导致免疫功能低下患者（如免疫缺陷综合征患者及接受造血细胞移植（HCT）或实体器官移植（SOT）的患者）发病率和死亡率的主要原因。[6] 药物治疗或疫苗方法尚未成功用于治疗HuNoV感染。[7] HCT和SOT后的T细胞免疫重建与症状性HuNoV感染的改善相关，通过输注病毒特异性T细胞恢复病毒特异性免疫是一种安全有效的疗法，用于治疗多种病毒感染，表明诺如病毒特异性T细胞（NST）疗法可能有效治疗这些感染。事实上，一项评估来自健康供体的新型"即用型"NST产品的I期临床试验（NCT04691622）正在进行中。[8] 该试验是此前临床前和临床研究工作的 culmination，涉及建立稳健的体外模型以研究感染免疫反应，识别适当的公共卫生重要性病毒菌株，了解这些菌株的遗传多样性和可突变性以靶向免疫优势抗原/表位，研究免疫逃逸机制，生成有效的临床级、符合良好生产规范（GMP）的NST，以及最重要的，在拟议NST疗法大规模临床转化前证明其安全性。[8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15] 我们此前将概念性科学想法转化为评估病毒特异性T细胞（VST）的临床试验的经验，促进了该临床试验的快速转化。[16, 17, 18, 19]

部分HLA匹配的VST（来源于HCT供体或第三方供体）已被用于靶向多种病毒感染（腺病毒、巨细胞病毒和人疱疹病毒6）。[20, 21, 22, 23, 24] VST的研究病毒靶标范围广泛，包括呼吸道病毒如人副流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒（ClinicalTrials.gov标识符：NCT04933968），以及严重急性呼吸综合征冠状病毒2（NCT04896606），还有HIV、诺如病毒（NCT04691622）、人乳头瘤病毒（NCT03351855）、人疱疹病毒6（NCT02108522）和寨卡病毒。[17, 25, 26, 27, 28] 要成功将这些新型VST转化为临床应用，需要建立在40年该领域研究基础上建立的稳健临床前框架。[29] NST的生成是一种新颖的治疗策略；阐明针对HuNoV的细胞性和体液性保护性免疫对于开发安全有效的NST至关重要。在健康人类中观察到了长期保护性细胞免疫，鉴定到了诺如病毒特异性记忆T细胞，且这些个体中大部分具有针对最常见GII.4 HuNoV菌株的T细胞免疫。[12, 15] 生成安全有效NST的核心是识别靶抗原（结构衣壳蛋白VP1和蛋白酶NS6）以及具有免疫优势HuNoV T细胞表位和限制性人类白细胞抗原（HLA）等位基因，方法是使用病毒肽-主要组织相容性（pMHC）复合物多聚体进行T细胞受体（TCR）映射。然而，由于HuNoV存在超过25种基因型的遗传多样性，患者和社区间病毒可突变性存在显著风险，可能导致NST输注后出现免疫逃逸。因此，具有针对多株病毒交叉反应性的NST至关重要。我们证明了生成符合GMP标准的、部分HLA匹配的、来源于第三方的即用型NST的可行性，这些NST靶向NS6和VP1抗原内的新型CD4和CD8限制性免疫优势表位。这些NST对来源于临床分离株的保守病毒序列的多种变异表位表现出高度交叉反应性，这是至关重要的。VST的效价评估是生物表征、功能功效和质量一致性的核心。FDA对VST等细胞疗法产品效价（生物活性）检测的监管要求包括作用机制和提供相关生物活性的定量测量。对于VST，这通常涉及通过多个经验证的检测方法（矩阵方法）证明抗原特异性（证明细胞仅识别并响应靶抗原）和功能能力。对于NST，抗原特异性和效价通过干扰素-γ酶联免疫斑点（ELISPOT）和细胞内细胞因子染色检测来证明。这些检测在以往的VST研究中被广泛用于效价评估。[30] NST被发现在多克隆细胞（同时显示CD4和CD8反应）和多功能细胞因子（产生白介素-2、TNF-α、INF-γ、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子）方面均有应答。中位扩增倍数为4.2倍，以2500万外周血单个核细胞为起始剂量，可生成约10^7 NST/m2的多个剂量。[8]

NST的生产方法是将外周血单个核细胞（PBMC）与单核细胞来源的树突状细胞（DC）（刺激1）和激活的T细胞（植物血凝素（PHA）刺激细胞）（刺激2）共培养，这些细胞已被代表NS6和VP1抗原的重叠诺如病毒肽脉冲，并在促进生长的细胞因子如IL2、IL7、IL12和IL15存在下进行培养。完整的生产细节在此处描述。[30]

最终NST药品产品经冻存保存，并按既定SOP进行无菌性、支原体、内毒素、表型、功能、HLA分型（确认生产过程中无混淆）和异体反应性检测。给药时，NST在水浴中解冻，将所需剂量抽取至标记注射器中，在床旁输注。

根据我们此前IND的经验，我们评估了风险领域并降低了这些风险，NST的CMC部分关键组件和重要信息总结于表2。

鉴于使用了异基因供体，供体资格认定至关重要，必须遵守FDA的21 CFR 1271法规。[31] 这包括及时采集传染病检测样本、使用FDA批准的检测试剂盒、由临床实验室改进修正案（CLIA）认证的实验室进行检测，以及筛查1271规定的所有传播性疾病。供体资格摘要记录必须始终随产品携带，这一FDA重点关注的领域常被忽视。

NST生产的另一个关键方面是使用合成的NS6和VP1肽。这些肽必须满足预定义的质量规格，并有风险缓解计划以防止引入可能扩增具有脱靶特异性T细胞的非期望肽序列。需要制定稳定性计划以确保肽在整个临床使用期间的完整性。此外，培养基中使用的一种试剂是从血浆中获取的人血清。重要的是，人血清生产中所用的血浆供体来源经病毒感染的检测并确认为阴性，尤其是由于生产过程中不包含额外的病毒灭活步骤。

因此，监管要求规定，人体血清应来源于符合血液制品献血资格标准的供体，这些血液制品用于直接输注。从工艺和制造控制角度来看，使用刺激组分（如肽脉冲的抗原呈递细胞和活化的T细胞（PHA增殖细胞））需要谨慎考虑。必须制定策略，确保这些组分在最终产品配制的过程中被去除或被灭活，包括明确的洗涤步骤以及（如适用）经验证的灭活方法，例如辐照。这些控制措施对于降低最终产品中非预期生物活性的风险至关重要。

产品表征和放行检验策略旨在平衡监管对安全性的期望与临床使用的实际限制。这包括建立适当的鉴别、纯度和效价检测方法，以及界定哪些放行结果必须在给药前获得，哪些可以在输注后报告并配合适当的风险控制措施。对于无供体来源治疗细胞（NSTs），一项放行标准包括CD3阳性细胞比例最低应超过65%，以确保最终产品中含有足够比例的T细胞。监管机构可能要求对所有细胞组分进行表征，包括基于风险的评估非目标人群及相关的缓解策略。能够证明抗原特异性功能的实验尤为重要，以支持所提出的作用机制。

最后，稳定性和临床递送考量对于确保产品完整性至关重要。必须定义冷冻保存和解冻后的操作条件，以支持产品在给药时的活力和功能。稳定性测试基于容器密封系统和冷冻保存所用的冷冻保护剂进行，因为两者都可能影响产品的完整性和性能。对这些系统的任何更改可能需要重新评估并制定修订后的稳定性计划。这包括定义可接受的储存时间、解冻后的有效期窗口，以及用于储存和输注的容器系统的考量。

自首次报告使用病毒特异性T细胞（VSTs）治疗人类病毒感染以来，大量临床研究已证明VSTs对多种病毒（如腺病毒、BK病毒、巨细胞病毒、EB病毒、人类疱疹病毒6型和JC病毒）具有安全性和有效性[29,32]。先前的VST研究在基于体表面积（BSA）的剂量方案下已证明具有良好的安全记录。基于此证据，本项NST研究正在进行中的I期剂量递增试验中，采用典型的3+3设计，测试3个剂量：1×10?、2×10?和4×10?/m2。（表4）鉴于使用VSTs治疗的受试者中毒性反应极少，预计本研究中的最大测试剂量将为最高拟定剂量4×10?/m2。Cruz等人调查了在1998年至2008年期间，美国某单中心输注381例VST产品治疗病毒感染和病毒相关癌症后发生的输注相关不良事件（即时发生和24小时内发生）。最常见的即时不良事件包括恶心和呕吐（2.7%）和低血压（1.3%），分别归因于二甲基亚砜和苯海拉明。24小时内发生的事件可能是由输注的T细胞引起的炎性、无细菌培养阳性的发热、寒战和恶心。有趣的是，T细胞来源（异体或自体）对不良事件的发生率没有影响[33]。归因于输注VSTs的移植物抗宿主病（GvHD）发生率低于5%，与澳大利亚和新西兰发表的结果相似[34]。造血干细胞移植后的移植物排斥极为罕见，但有相关报道[35]。重要的探索性目标包括对T细胞进行药代动力学（PK）/药效动力学（PD）研究，以及在诺如病毒（HuNoV）感染患者接受NSTs治疗期间调查基因组的稳定性及遗传变异的产生。为最大限度降低同种异体反应相关毒性并最大化NSTs的效力，选择适当的第三方供体T细胞产品取决于第三方供体与受体之间适当的HLA匹配，以确保靶向预期的病毒表位。

在证明能够生成符合GMP标准的NSTs用于治疗HuNoV感染的可行性之后，一项I期试验已启动并正在入组。如果证明安全，NSTs可能成为免疫抑制宿主中一种可行的治疗方案，尤其适用于没有其他有效预防或治疗选择的情况。利用肽混合物进行更快的制造平台以及增加第三方来源T细胞的现成可用性，可以克服当前供体来源的抗原呈递细胞脉冲刺激T细胞需数周才能生成VSTs的局限性。尽管其他新型VSTs（如针对SARS-COV19的）在早期试验中显示出令人鼓舞的结果[36]，但未来的成功和商业化将取决于在精心设计的随机对照试验中证明有效性。

采用性细胞疗法，如CAR T细胞，正在积极探索用于中枢神经系统（CNS）肿瘤患者。令人鼓舞的是，初步的学前和临床经验表明，这些疗法有可能改变CNS肿瘤患者的治疗格局[37, 38, 39, 40, 41]。这些早期CNS CAR T细胞疗法试验面临着独特且复杂的挑战，并受益于多学科团队方法，包括细胞治疗专家、神经肿瘤学家、神经病学家、神经外科医生、重症监护医生、制造专家和监管专家的整合团队，以及不断演进的临床试验设计，以反映个体患者的临床经验以支持其发展。CNS肿瘤CAR T细胞脑室内递送的特有问题包括产品制造的可行性、CAR T细胞的管理、独特的神经毒性的临床管理、相关性分析和疗效评估等一系列挑战。

CNS肿瘤CAR T细胞疗法的前临床模型已发现独特的毒性谱，与传统细胞毒性和靶向化疗所见的不同。Mount等人通过小鼠H3K27M突变弥漫性脑干胶质瘤（DIPG）的前临床研究，展示了免疫治疗后局部肿瘤炎症的影响——使用GD2-CAR T细胞治疗的小鼠因瘤内脑干炎症导致脑室受压性梗阻性脑积水，进而导致一小部分小鼠死亡[42]。尽管该小鼠模型中肿瘤被清除，但在炎症期间部分小鼠的死亡说明了在CNS特定神经解剖位点发生肿瘤炎症的后果。这一前临床经验预示了后来被描述为局部肿瘤炎症相关神经毒性（TIAN）的现象，这是一种继发于采用性细胞疗法后肿瘤浸润性脑组织炎症的独特毒性。这种炎症诱导的肿瘤水肿导致空间受限，如占位效应，进而阻塞脑脊液流动和脑积水，如果不治疗可能导致脑疝。TIAN的第二种表现形式表现为症状的暂时性恶化或出现定位于肿瘤浸润脑区的新症状，如在靶在瘤炎症可诱导肿瘤浸润神经回路的功能障碍[43]。基于这一前临床经验和神经重症监护的基本原则，在一项使用GD2-CAR T细胞治疗儿童和青年弥漫性脑干胶质瘤（DIPG）或脊髓弥漫性中线胶质瘤（sDMG）的I期临床试验设计（NCT04196413）中，实施了特定的安全措施[37,44]。所有患者均放置了脑室内导管（如Ommaya导管或脑室腹腔分流管）以测量颅内压（ICP），并在临床需要时引流脑脊液以治疗暂时性炎症相关脑积水，这种方法在其他CNS CAR T细胞试验中也有应用[38,45]。为监测治疗后是否发生导致颅内压升高的TIAN，该临床试验在CAR T细胞输注后第+3、7、14、21和28天通过Ommaya储液囊进行标准化的颅内压检查，并可根据临床检查和生命体征随时进行紧急颅内压测量。

CNS肿瘤患者的CAR T细胞制造面临独特挑战，特别是许多CNS肿瘤CAR T细胞试验为每位患者提供多剂固定剂量的CAR T细胞。为此，采取了多项制造改进措施以优化CAR T细胞质量。首先，从手动制造平台（如商业化CAR T细胞中使用的[46,47]）转变为封闭式制造平台Miltenyi Prodigy，这减少了产品处理中的变异并提高了所产生CAR T细胞质量的一致性[48, 49, 50]。其次，从新鲜或冷冻的患者单采成分中分选CD4和CD8 T细胞[51,52]。最后，使用双顺反逆转录病毒载体转导的T细胞（包括GD2.41BB.z CAR和iCasp9，来自Bellicum Pharmaceuticals Inc），在IL-7和IL-15存在下扩增，以提高T细胞扩增动力学和功能[53, 54, 55, 56]，并在达沙替尼（dasatinib）环境中培养，以改善CAR T细胞的适应度[57]。iCasp9是一种"安全开关"，通过小分子二聚化剂AP1903诱导，促进转导CAR T细胞的凋亡，从而有助于减轻CAR介导的毒性。为利用这一新型制造方法，制造团队对多名健康供体进行了评估，分析了制造过程不同时间点的产品特性。结果表明平均制造周期为7天，并成功为所有受试者制造出多个治疗剂量的产品。

在每次CAR T细胞输注前，细胞会被解冻、计数和洗涤以去除二甲基亚砜，这是各机构的常见做法[58]。值得注意的是，这一解冻洗涤方法已被许多中心[38]转变为解冻稀释程序，这可能会改善大规模递送CAR T细胞的可行性，随着各中心从单中心向多中心临床试验的转变，这一点将变得更加重要。制备完成后，CAR T细胞通过Ommaya导管使用23号蝶形针进行递送。通过蝶形针穿刺Ommaya后，测量开放压，抽取脑脊液进行临床和研究检测，然后获取关闭压。随后在2分钟内递送3毫升CAR T细胞，继以3毫升无菌生理盐水冲洗。患者平躺30分钟，然后每侧侧卧15分钟，以促进CAR T细胞的均匀分布（图2）。

鉴于脑室内细胞疗法治疗CNS肿瘤患者的临床经验有限，每例受试者都能为临床试验提供宝贵的经验教训。例如，DIPG患者因脑桥膨胀和第四脑室受压而有梗阻性脑积水的风险，任何炎症引起的水肿都会加重这一风险。然而，正如临床试验所见的，脑干和脊髓弥漫性中线胶质瘤患者在炎症高峰期可能出现暂时性交通性脑积水。这表明脑积水可以是多因素驱动的，炎症可影响脑脊液生成、流动和/或再吸收的正常生理功能。这一观察结果再次强调了即使没有脑干病变的患者也需要放置Ommaya导管的必要性。

随着时间的推移，对不同毒性的管理也积累了经验。例如，对于因TIAN导致的持续颅内压升高且通过Ommaya储液囊间歇性脑脊液引流反应不佳的患者，通过置入并固定于Ommaya储液囊的蝶形针进行持续脑脊液引流显示出获益。另一项经验支持早期使用阿那白滞素（anakinra）来减轻TIAN，其最佳使用方案在该背景下应进一步研究。

此外，该试验清楚地表明sDMG患者的TIAN临床表现与DIPG患者存在差异。例如，脊髓中间侧角（T1-L3）的神经电生理功能异常可导致自主神经功能障碍，C3-C5的TIAN可导致膈神经功能障碍，引起呼吸肌肉急性衰竭。虽然我们最初使用DIPG的临床经验来指导sDMG患者的剂量递增，但在临床试验早期积极治疗患者期间获得的经验教训促使我们决定将DIPG和sDMG患者的剂量递增分开进行，并凸显了完善临床试验方案的重要性。

对于通过脑室内给药接受CAR T细胞疗法的CNS肿瘤患者，拥有多学科团队支持灵活的临床试验设计至关重要。这种方法能够基于从患者中获得的经验教训优化临床试验方案，目标是开发出安全可行且能带来临床意义获益的治疗方案。最终，与多中心试验的跨机构合作将增加患者获得治疗的途径，并有助于更好地理解毒性和疗效，最终改善患者预后。靶向CD19和/或CD22的CAR T细胞在复发和难治性B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）患者中显示出显著活性。

然而，这两种方法仍然受到治疗相关毒性的限制，部分患者由于CAR T细胞扩增和持久性不足而无法诱导缓解，以及由抗原调节或丢失介导的免疫逃逸。[59] 对于CAR治疗后复发的患者，治疗选择有限，针对新型靶点的策略可能成为这一亚组患者的潜在治疗方案。胸腺基质淋巴细胞生成素受体（TSLPR）是一种由CRLF2和IL7Ra链组成的异源二聚体细胞因子受体，正常表达于上皮细胞表面。[60,61] 当与配体TSLP结合后，TSLPR通过诱导单核细胞释放趋化因子和激活特定树突状细胞亚群，在炎症反应中发挥重要作用。[62,63,64,65] B-ALL中CRLF2重排患者报告有TSLPR表面过表达现象，且与JAK/STAT及其他激酶信号通路的激活相关。[62,63,64,65,66] CRLF2重排（伴有TSLPR过表达）现已证实发生在15%-30%的年长儿童及青少年/年轻成人（AYAs）中[66,67,68]，以及20%-40%的Ph-like ALL年长成人患者中[67,69,70,71,72]。在原始B-ALL样本中，TSLPR表面表达可通过流式细胞术易于检测到，其水平与CD19相当；白血病母细胞上CD19和TSLPR的平均位点密度分别约为8,000和8,500个位点/细胞。TSLPR表面检测的术前验证已在美国国家癌症研究所和费城儿童医院完成。鉴于CRLF2重排B-ALL在跨越年龄谱中的高频发性以及TSLPR可通过流式细胞术易于检测，研究人员开发了一种抗TSLPR CAR T细胞构建体用于临床转化。[73]

在CAR设计中纳入膜结合标记作为安全开关，允许一种次要方法在患者中检测CAR T细胞。最常用的标记是截短表皮生长因子受体（trEGFR）标记，该标记包含胞外和跨膜结构域，但缺乏EGFR的胞内信号转导结构域。trEGFR位于载体中的2A核糖体跳跃元件之后，应与CAR以1:1的比例表达。在开发TSLPR CAR过程中，发现转导T细胞表面可检测到的TSLPR CAR和trEGFR水平存在差异，trEGFR检测水平高于TSLPR CAR检测水平。这引发了关于量化CAR T细胞转导的最佳方法以及定义CAR阳性细胞频率用于产品表征和剂量确定的重要问题。有趣的是，无论是否检出表面TSLPR CAR的trEGFR阳性细胞，在杀伤肿瘤细胞方面效果相当。这些发现提示CAR表达可能存在但低于检测方法的检出限，而非不存在。（表3）

TSLPRCAR/trEGFR IND申请中包含的初始体内研究主要使用经改造以过表达TSLPR的REH白血病细胞进行，结果显示TSLPRCAR/trEGFR T细胞在实验终点时表现出比对照CD19/CD22 CAR T细胞更强的表观持久性。然而，两种产品的持久性采用了不同的检测策略进行评估：TSLPRCAR/trEGFR T细胞使用trEGFR转导标记进行定量，而CD19/CD22 CAR T细胞则通过直接细胞表面CAR染色进行定量。初始申请还包含了一项使用表达内源性TSLPR水平的JH331患者来源异种移植模型（PDX）的单一研究。FDA要求在JH331 PDX模型中补充进行抗肿瘤活性和持久性的额外研究，使用至少来自两个独立供者的TSLPRCAR/trEGFR T细胞制造，并进行充分的随访以评估长期持久性、生物分布和潜在的克隆扩增。

为满足这些要求，使用两个独立供者制造的TSLPRCAR/trEGFR T细胞在植入JH331白血病的免疫缺陷NSG小鼠中进行了评估。每个供者组别五只小鼠分别接受模拟转导T细胞、TSLPRCAR/trEGFR T细胞或CD19CAR/trEGFR T细胞，从而提供了一个允许两种CAR T细胞产品使用相同EGFR检测方法进行评估的对照。动物随访时间为64天，包括CAR T细胞治疗组肿瘤清除后超过三周，并在血液中进行纵向持久性评估，研究终止时在骨髓和脾脏进行评估。TSLPRCAR/trEGFR和CD19CAR/trEGFR T细胞表现出相当的持久性。

本例说明了意外的持久性或另一种产品特异性安全信号可能促使开展额外的体内研究，以解决特定的监管问题，同时也强调了在解读细胞治疗产品间比较时考虑检测方法差异的重要性。在本例中，直接CAR检测低估了CAR T细胞频率，而trEGFR等转导标记提供了更准确的转导细胞度量。尽管如此，异种模型中的持久性不应被假定可以直接预测患者中的持久性。

针对TSLPR CAR T细胞的生产，已建立了一套稳健且全面的制造和质量控制框架，确保一致性、安全性和符合监管标准。自体T细胞通过白细胞分离术采集，并使用GMP级慢病毒载体（EF1a-TSLPR-trEGFR CAR）进行基因修饰以表达TSLPR CAR。制造流程在Miltenyi CliniMACS Prodigy仪器上进行了广泛验证，采用自动化封闭系统操作以提高可靠性和可扩展性。

流程从T细胞分离开始，使用抗CD4和抗CD8磁珠富集CD3+ T细胞群体。分离后，细胞进行慢病毒转导、扩增和冷冻保存。根据临床和物流需求，T细胞可冷冻保存以备后续使用或新鲜培养。为改善解冻后的一致性，引入了"预解冻"方案，使冷冻保存的细胞在过夜恢复后再启动培养。此修改减少了解冻后的变异，提高了不同生产批次中转导效率和细胞扩增的一致性。

质量控制框架涉及生产各阶段的严格测试。包括细胞活力、纯度、转导效率和无菌性的评估。最终产品含≥80%的CD3+ T细胞，并满足严格的安全性放行标准，包括无菌测试阴性、复制型慢病毒（RCL）检测以及载体拷贝数≤5拷贝/细胞。此外，产品的冷冻保存方法使用GMP认证的赋形剂，包括CryoStor CS10和Plasmalyte-A，确保长期稳定性。（表2）稳定性研究确认冷冻保存产品在长达四个月内保持活力和表型完整性，解冻后活力始终超过所需阈值。这些验证和质量控制措施共同支持了TSLPR CAR T细胞产品的安全性、一致性和临床就绪性。

尽管该试验目前正在入组中（NCT07572136），但目前尚无该产品的临床经验。然而，CD22 CAR T细胞在B-ALL中的人体首次评估经验表明，靶向同一疾病中的不同抗原可能导致与CD19导向CAR T细胞治疗不同的毒性特征。使用CD22 CAR T细胞时，CRS毒性通常较轻，ICANS也是如此，但出现了噬血细胞性淋巴组织细胞增多症（HLH）样毒性[74,75]，并为后来被称为免疫效应细胞相关HLH样综合征（IEC-HS）奠定了基础。[76]

即使在CAR T细胞已证实获益的疾病中，靶向新型抗原的产品也会带来独特的科学、制造和临床挑战，需要广泛的规划和协调。对于本试验，需要一种新的经验证的检测方法对患者样本中的TSLPR进行评估，以筛选资格，因为该靶点不属于常规评估范围。另外，关于CAR T细胞计数的新见解仅在进行促进可比比较的实验时发现差异时才浮出水面——突出了临床前调查的关键作用以及对试验设计的启示。总体而言，本案例研究说明了临床前、制造、监管和临床专业知识的紧密整合对于新型细胞治疗从概念到人首次试验的成功转化至关重要。

结论

为美国FDA新药临床研究申请（IND）准备新型生物或细胞治疗产品需要密切关注安全性[77]，并深入理解复杂的免疫学原理、检测方法、GMP制造和监管要求，需要在通路的每一步进行精心协调的多学科规划。[78] 尽管存在独特挑战，但细胞治疗可以为治疗选择有限的疾病提供靶向抗肿瘤和抗病毒治疗。

免责声明

本研究部分由美国国立卫生研究院（NIH）内部研究项目资助。NIH作者做出的贡献是在其作为NIH联邦雇员的官方职责范围内完成的，符合机构政策要求，被视为美国政府作品。然而，本文提出的发现和结论仅代表作者观点，不一定反映NIH或美国卫生与公众服务部的观点。

作者贡献

J.M.、J.T.、P.Y.、C.C.、S.H.、P.J.H.和N.N.S.对论文初稿做出了贡献。所有作者均通过各自中心参与了临床试验，并对最终手稿进行了审阅和实质性修改。

利益披露

P.J.H.担任CARTx、March Biosciences和MFX的顾问或顾问委员会成员，是病毒特异性T细胞相关知识产权的发明人。N.N.S.曾获得Lentigen、VOR Bio和CARGO Therapeutics的研究资助。N.N.S.曾参加VOR、ImmunoACT和Sobi的顾问委员会会议（无酬金）。N.N.S.从NIH获得版税（该关系于2025年7月终止）。C.M.B.是Cabaletta Bio的董事会成员，并担任科学顾问。

Jasia Mahdi | Jay Tanna | Piriya Yoganathan | Christopher Chien | Michelle Monje | Steven Highfill | Patrick J. Hanley | Catherine M. Bollard | Fahmida Hoq | Naomi Taylor | Sneha Ramakrishna | Anant Vatsayan | Nirali N. Shah

贝勒医学院儿科系儿童神经病学与发育神经科学科，休斯顿，得克萨斯州