《Developmental & Comparative Immunology》：Bacillus BS08 and BA08 isolated from the grass carp (
Ctenopharyngodon idella) intestine improve growth performance and enhance resistance to GCRV-II infection in grass carp
编辑推荐：
•从草鱼肠道中分离出23株枯草芽孢杆菌、8株地衣芽孢杆菌和52株乳球菌。•BS08、BA08、LL01和LL06的代谢物在体外表现出热稳定的抗GCRV-II活性。•饲料中添加BS08、BA08、LL01或LL06增强了草鱼的生长性能并上调了免疫相关基因的表达。•饲料中添加BS
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从草鱼肠道中分离出23株枯草芽孢杆菌、8株地衣芽孢杆菌和52株乳球菌。
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BS08、BA08、LL01和LL06的代谢物在体外表现出热稳定的抗GCRV-II活性。
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饲料中添加BS08、BA08、LL01或LL06增强了草鱼的生长性能并上调了免疫相关基因的表达。
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饲料中添加BS08或BA08增强了草鱼对GCRV-II感染的抵抗力。
引言
益生菌被定义为在给予足够数量时能对宿主产生健康益处的活微生物，作为抗生素的潜在替代品而受到广泛关注（Wang等，2022）。在水产养殖中，益生菌有许多优点，如促进消化吸收、增强免疫力、改善生长性能、抑制病原体增殖和优化水质（Avella等，2010；Harikrishnan等，2010）。芽孢杆菌属和乳杆菌属（LAB）是水产养殖中常用的益生菌，已被广泛报道作为饲料添加剂来促进水生动物生长（Yi等，2018）。饲喂地衣芽孢杆菌显著提高了草鱼的体重增长率（PWG）和特定生长率（SGR）（Qin等，2020）。分别饲喂地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌给杂交鲟（Acipenser schrenkii ♂ × Acipenser baeri ♀）、大口黑鲈（Micropterus salmoides）、杂交石斑鱼（Epinephelus fuscoguttatus ♀ × E. lanceolatus ♂）或尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus），显著促进了其生长性能（Fei等，2018；Huang等，2024；Wang等，2024；Xie等，2024）。此外，使用乳杆菌属作为饲料添加剂也促进了凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）的生长（Zuo等，2019）。
病毒性疾病仍然是人类和动物面临的主要挑战。尽管疫苗接种是预防病毒感染的主要策略，但不断演变的疫情与现有疫苗之间的差异往往导致疫苗接种效果欠佳。此外，对于许多新出现或重新出现的病毒，目前尚无可用疫苗。因此，迫切需要探索替代或补充策略来应对病毒感染。越来越多的证据表明，益生菌及其代谢物可以增强水生动物抗病毒的免疫力。Liu等指出，饲喂枯草芽孢杆菌促进了石斑鱼（Epinephelus coioides）在石斑鱼虹彩病毒（GIV）感染后的存活率（Liu等，2012）。在克氏原螯虾（Procambarus clarkii）饲料中添加地衣芽孢杆菌降低了其在白斑综合征病毒（WSSV）感染后的死亡率（Lai等，2020；Xu等，2021）。饲喂含有枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和微小芽孢杆菌混合物的饲料给罗非鱼（Oreochromis mossambicus）降低了其在罗非鱼湖病毒（TiLV）感染后的死亡率和病毒载量（Waiyamitra等，2020）。此外，地衣芽孢杆菌JW代谢物的乙酸乙酯提取物对鲢病毒血症病毒（SVCV）表现出强抗病毒活性，在体外抑制率超过95%，在体内感染鲢鱼的存活率提高了约14%（Song等，2022）。这些发现强调了益生菌及其代谢物作为水产养殖中有效抗病毒剂量的潜力。
草鱼（Ctenopharyngodon idella）因其卓越的生长性能、较低的养殖成本、可观的经济效益和高蛋白质含量，是中国主要的淡水鱼种之一（Lu等，2024；Tian等，2023）。GCRV是一种无包膜二十面体病毒，属于呼肠孤病毒科（Spinareoviridae）中的水呼肠孤病毒属（Aquareovirus）。根据基因序列，GCRV目前被分为三个基因型，包括GCRV-I、GCRV-II和GCRV-III，其中GCRV-II的流行率和毒力最高（Su等，2021）。随着集约化水产养殖的扩大，草鱼呼肠孤病毒（GCRV）引起的草鱼出血病（GCHD）频繁爆发，给草鱼养殖带来了严峻挑战（Kong等，2023）。因此，开发有效且有益的益生菌以预防和控制草鱼养殖中的GCRV-II感染具有巨大前景。
基于上述考虑，本研究旨在从草鱼肠道中分离具有潜在抗病毒活性的益生菌株。我们从草鱼肠道中分离出31株芽孢杆菌属和52株乳球菌。经过溶血试验、抗生素敏感性试验、产酶试验、产酸试验和体外抗病毒试验后，选择了BS08、BA08、LL01和LL06来评估其肠道定殖能力、促生长能力和抗GCRV-II能力。我们的结果表明，饲料中添加BS08和BA08显著增强了草鱼的生长性能并提供了对GCRV-II感染的保护，使其成为水产养殖益生菌进一步开发的有前景的候选菌株。
章节摘要
鱼、细胞、细菌和病毒
健康的草鱼来自中国湖北、广东、重庆和贵州的13个养殖场。草鱼鼻纤毛细胞（PSF）细胞在28°C、含10%胎牛血清（FBS）、链霉素（100 μg/ml）和青霉素（100 μg/ml）的M199培养基中培养。芽孢杆菌属和乳杆菌属从草鱼肠道中分离。GCRV-II株系GCRV-AH528保存于本实验室。
从草鱼肠道中分离鉴定芽孢杆菌属和乳杆菌属
用MS-222麻醉草鱼并用75%酒精消毒。解剖肠道
从草鱼肠道中分离芽孢杆菌属和乳杆菌属及溶血试验
从健康草鱼肠道中共分离出83株菌株，包括23株枯草芽孢杆菌（命名为BS01-BS23）、8株地衣芽孢杆菌（命名为BA01-BA08）和52株乳球菌（命名为LL01-LL52）。溶血试验显示所有菌株均无溶血性（表2）。
芽孢杆菌属和乳球菌的抗生素敏感性试验
测试了31株芽孢杆菌属和52株乳球菌对22种常用抗生素的敏感性。结果表明，除BS01和BS02外，其余29株芽孢杆菌属对较少
讨论
近年来，益生菌因其多样的生物学功能在水产养殖中受到越来越多的关注。特别是，芽孢杆菌属和乳杆菌属已被广泛报道作为饲料添加剂来增强鱼类生长和抗病力（Huang等，2024；Wang等，2024；Xia等，2024；Xie等，2024；Zuo等，2019）。既往研究表明，饲喂地衣芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌，这些
结论
总之，从草鱼肠道中获得了31株芽孢杆菌属和52株乳球菌。通过溶血试验、抗生素敏感性试验、产酶试验和产酸试验，选择了BS08、BA08、LL01和LL06作为候选益生菌株。所有四株产生的代谢物在PSF细胞中对GCRV-II表现出显著的抗病毒活性。此外，饲喂这四株菌株中的任意一种都显著促进了生长
CRediT作者贡献声明
涂家岗：写作–审查与编辑，监督，经费获取。张永安：监督，经费获取。刘安琪：可视化，形式分析，数据整理。其鑫：可视化，形式分析，数据整理。姜辉：写作–初稿，调查，数据整理
伦理声明
动物实验按照实验动物伦理程序和指导方针进行，并获得了华中农业大学动物伦理委员会的批准（HZAUFI-2025-0106）。
动物实验
本研究按照ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。本研究获得了华中农业大学动物伦理委员会的批准。（批准号：HZAUFI-2025-0106）
利益冲突声明
所有作者均已批准本手稿并声明没有利益冲突。本文为原创且未在其它地方考虑中。
致谢
本工作得到国家重点研发计划（2023YFD2400701）、国家自然科学基金（U23A20252）和中央高校基本科研业务费（2662026SCPY006）的支持。
姜辉|其鑫|刘安琪|张永安|涂家岗
