Zfpm1调控心内膜-间充质转化及心内膜细胞分化的机制研究

《Developmental Biology》：Zfpm1 regulates endothelial-mesenchymal transition and endocardial cell differentiation

　　

英文摘要翻译： 调控心内膜（EC）细胞命运的特异性调控因子尚未完全明确。EC细胞与内皮（ET）细胞在转录组水平上存在显著差异。转录因子Zfpm1（Fog1）是EC细胞特化的调控因子。Zfpm1敲低可损害EC细胞分化、内皮-间充质转化（EndoMT）、收缩性及搏动功能。 哺乳动物心脏发育涉及形成心内膜、心肌和心外膜的多条细胞谱系。鉴定多能心脏祖细胞为心肌谱系特化提供了见解，但关于EC细胞起源的了解仍较少。EC细胞衬覆心脏内层，ET细胞衬覆源自心脏并连接全身的血管，二者源自共同的多能中胚层祖细胞群。EC细胞具有瓣膜形成、心室分隔、心肌分化及后期心室形态发生所需的功能特性。鉴定EC细胞发生与功能的关键因子，有助于理解先天性心脏病的潜在病因——先天性心脏病是最常见的重大先天畸形，发生于近1%的活产婴儿和10%的流产胎儿中，进而为心脏修复与再生的潜在治疗途径开发做出贡献。 在分子水平上，EC细胞如何被特化仍存在认知空白。心脏发育过程中，EC和ET细胞共享形态学特征和分子标记，包括VE-钙黏蛋白（Cdh5）、CD31（Pecam1）和VEGFR2（Kdr）。尽管存在这些相似性，两类细胞对外源刺激的反应不同。EC细胞在功能上具有独特性，能够经历内皮-间充质转化（EndoMT）形成瓣膜，并协调心肌分化和小梁形成。转录因子Nfatc1（活化T细胞核因子1）作为EC细胞分化和功能的早期标记（小鼠E7.5），可将EC细胞与ET细胞区分开来。然而，Nfatc1不太可能是EC细胞命运决定的唯一贡献者，因为敲除小鼠仍具有心内膜，尽管其瓣膜发育不全。NRG1（神经调节蛋白-1）在心室心内膜中表达，通过Nrg1-ErbB2/4信号轴在早期心内膜-心肌信号传导中至关重要，敲除胚胎显示心室小梁缺失、心肌细胞增殖异常，并在E10.5前致死。 为鉴定EC细胞特化的关键调控因子，研究人员生成了NFATc1-mCherry BAC转基因小鼠品系，包含受Nfatc1启动子及其上下游关键基因组调控序列控制的mCherry报告基因。该品系在小鼠胚胎EC细胞中提供早期心内膜特异性的NFATc1-mCherry报告基因表达。NFATc1-mCherry BAC转基因忠实重现了EC细胞内源性Nfatc1表达模式，可作为早期心脏发育过程中标记和分离EC细胞的工具。 ES细胞在悬滴中分化形成胚胎体（EBs）。体外EB分化模型已被用于重现体内发育过程，EBs可分化为多种细胞谱系。值得注意的是，EBs重现了心脏谱系的分化，其时空协调性镜像了早期胚胎发生过程中观察到的模式。EBs表达EC细胞、心肌细胞和血管ET细胞的特征性标记。当使用携带NFATc1-mCherry BAC转基因的ES细胞系时，mCherry表达反映了EC细胞特异性的内源性Nfatc1表达。此外，在EB分化过程中，EC和心肌细胞位置邻近，类似于体内早期心脏发生过程中两个谱系之间旁分泌信号传导至关重要的情形。EB分化系统重现了EC细胞发育的早期事件，因此可用于鉴定参与EC细胞分化的新型标记物。 NFATc1-mCherry BAC转基因小鼠提供了一个模型系统，适用于在特定细胞类型及更广泛的心脏组织中鉴定基因和调控因子。转录组分析已鉴定出EC和ET细胞之间的差异表达基因，使EC细胞能够采用其独特的功能特性，这对它们的分化至关重要。Zfpm1——一个此前已知与非综合征型法洛四联症（TOF）相关的基因——已成为EC细胞发育中的重要候选基因。虽然体内斑马鱼模型已显示Zfpm1在心脏发育中发挥作用并调控心室小梁形成，但关于Zfpm1如何在基于哺乳动物干细胞的系统中参与EC细胞特化和EndoMT，目前知之甚少。

论文解读

一、研究背景与科学问题

哺乳动物心脏发育涉及心内膜、心肌和心外膜多条细胞谱系的协调形成。心内膜细胞衬覆心脏内层，与衬覆血管的内皮细胞源自共同的多能中胚层祖细胞群，二者在形态学和分子标记上高度相似，均表达VE-钙黏蛋白（Cdh5）、CD31（Pecam1）和VEGFR2（Kdr）。然而，心内膜细胞具有独特的功能特性，能够经历内皮-间充质转化形成心脏瓣膜，并协调心肌分化和心室小梁形成。尽管Nfatc1（活化T细胞核因子1）作为心内膜细胞分化的早期标记物（小鼠E7.5）已被广泛认知，但Nfatc1敲除小鼠仍能形成心内膜（尽管瓣膜发育不全），提示其他基因同样参与心内膜细胞命运决定。先天性心脏病作为最常见的重大先天畸形，发生于近1%的活产婴儿中，鉴定心内膜细胞发生与功能的关键调控因子，对理解先天性心脏病病因及开发心脏修复与再生的治疗途径具有重要意义。

二、研究内容与主要结论

研究人员利用NFATc1-mCherry BAC转基因小鼠品系，通过流式分选获取E9.5胚胎的mCherry+/CD31+心内膜细胞和mCherry-/CD31+内皮细胞，进行批量RNA测序，鉴定出573个差异表达基因，证实心内膜细胞在转录组水平上显著区别于内皮细胞。通过基因本体论功能富集分析，筛选出19个候选基因，结合公共单细胞RNA测序数据和文献检索，最终锁定Zfpm1、Pdlim3、Fbn1和Dok4四个最强候选基因。利用强力霉素诱导的shRNA敲低体系在胚胎体分化模型中验证功能，发现Zfpm1敲低显著降低心内膜细胞标记物Nfatc1的表达（mRNA水平降低约40%，蛋白水平降低约65%），减少NFATc1阳性心内膜细胞数量，损害细胞跨膜迁移能力（模拟内皮-间充质转化过程），并导致胚胎体收缩节律异常。人源单细胞核转录组数据进一步证实ZFPM1在人类发育心脏的心内膜细胞中表达，提示该调控机制在物种间保守。

三、主要技术方法

研究人员采用的主要技术方法包括：利用NFATc1-mCherry BAC转基因小鼠（含mCherry报告基因，受Nfatc1启动子及上下游调控序列控制）标记并分离心内膜细胞；流式细胞分选获取心内膜（mCherry+/CD31+）和内皮（mCherry-/CD31+）细胞群；批量RNA测序（Illumina HiSeq2500平台，SMART-Seq v4超低输入RNA建库）结合DESeq2差异表达分析；公共单细胞RNA测序数据集（GSE126128和GSE121708）整合分析（Seurat v4.2.0）；RT-qPCR基因表达验证；强力霉素诱导的shRNA慢病毒载体构建敲低小鼠胚胎干细胞系；悬滴法胚胎体分化模型；蛋白质印迹法蛋白表达检测；免疫荧光染色；Transwell细胞侵袭迁移实验；活细胞视频收缩性分析；人源单细胞核转录组数据（49,227个单核，来自8.6、9.0和10.7孕周胎儿）再分析。

四、研究结果

心内膜细胞与内皮细胞具有独特的转录组特征。通过批量RNA测序鉴定出573个差异表达基因，层次聚类显示两类细胞群明显分离。心内膜细胞高表达Nfatc1和Nrg1（神经调节蛋白-1），内皮细胞高表达Spry1和Cdh2。基因本体论分析显示心内膜细胞富集于三尖瓣形成、TGFβ激活调控、心脏瓣膜形态发生等生物学过程，以及胰岛素生长因子结合、转化生长因子β结合、bHLH转录因子结合等分子功能。

转录组分析鉴定心内膜细胞发育候选基因。214个在心内膜细胞中显著上调（log?倍数变化>1）的基因经功能富集分析筛选出19个候选基因，结合MGI数据库（HMDC和GXD）文献检索，12个基因与瓣膜发育缺陷或早期心脏发育形态发生相关。整合两个公共单细胞RNA测序数据集后，仅Irx5、Fbn1、Zfpm1、Pdlim3和Dok4在心内膜/内皮及内皮-间充质转化细胞群中具有高表达特异性，RT-qPCR验证了其中四个基因在心内膜细胞中的高表达。

体外分化模型中候选基因的功能验证。在胚胎体分化D8-D10心脏谱系分化关键窗口期，Zfpm1敲低在D6（约60%降低）和D10（约40%降低）显著降低mRNA水平，D10蛋白水平降低约75%。Zfpm1敲低导致Nfatc1在D10的mRNA水平降低约40%、蛋白水平降低约65%，而Pdlim3敲低对Nfatc1表达无显著影响。

Zfpm1对胚胎体分化过程中心内膜细胞特化至关重要。免疫荧光定量证实Zfpm1敲低胚胎体在D10的NFATc1阳性细胞数量显著减少。Transwell实验显示Zfpm1敲低胚胎体在D10的跨膜迁移细胞百分比显著降低（20%对31%），提示Zfpm1表达对心内膜细胞特化及内皮-间充质转化能力至关重要。

ZFPM1敲低影响胚胎体收缩表型。活细胞视频分析显示，非诱导对照胚胎体呈现同步收缩模式，收缩与舒张事件位移速率相似；Zfpm1敲低胚胎体则表现为异步收缩模式，收缩与舒张事件间无明确位移模式，提示心肌细胞分化缺陷，可能源于心内膜细胞分化受损及两谱系间的相互作用失调。

ZFPM1在人类心脏中的表达。人源单细胞核转录组数据（49,227个单核，来自三个胎儿）再分析显示，ZFPM1与NFATc1在人心内膜细胞簇中具有相似的表达模式，定量分析证实ZFPM1存在于心内膜细胞中，表明小鼠与人类发育胚胎心脏中的表达模式具有保守性。

五、讨论与结论

Zfpm1（又称Fog1）是一种锌指蛋白，作为GATA1转录因子的辅因子参与心脏发育。此前Tie2-Cre条件性内皮特异性敲除小鼠已显示心脏表型，证实其在内皮衍生谱系中的作用。人类ZFPM1突变与非综合征型法洛四联症相关（约占TOF的80%），区别于约20%的综合征型病例（其中15%与22q11缺失综合征中的TBX1突变相关）。E10.5小鼠心脏的空间转录组学和单细胞RNA测序显示，Zfpm1在心脏流出道所有区域广泛均匀分布，提示其致病性可能通过心内膜或心肌与心内膜共同效应实现。本研究证实Zfpm1敲低影响心内膜细胞标记物Nfatc1表达，支持其在适当发育时间和位置对心内膜细胞的作用。Zfpm1对胚胎体分化过程中心内膜细胞谱系特化至关重要，其敲低还影响胚胎体收缩表型，可能直接作用于心内膜或心肌细胞，或源于心内膜与心肌细胞间信号串扰的失调，亦不能排除对非心内膜细胞的旁分泌效应。研究结论表明，胚胎心内膜是转录组水平上独特的内皮亚群，该系统性方法为鉴定心内膜特异性转录本及研究其在发育心脏中的组织或细胞特异性功能提供了有效途径，支持胚胎体模型在解析人类基因突变对早期心脏发育影响机制中的应用价值。