基于唾液生物标志物监测断奶后仔猪口服产肠毒素大肠杆菌F4/F18疫苗期间的健康状况

《Developmental & Comparative Immunology》：Monitoring health status of post-weaning piglets during oral vaccination against Enterotoxigenic Escherichia coli F4/F18 using salivary biomarkers

　　

本研究旨在利用唾液生物标志物评估断奶后仔猪在野外条件下口服产肠毒素大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC）F4/F18疫苗后的健康状况。研究人员将3,776头杜洛克×（长白×大白）断奶仔猪分为疫苗接种组（VAC）和未接种对照组（CONTROL），在不同时间点采集唾液样本，检测急性期蛋白C反应蛋白（C-reactive protein, CRP）和触珠蛋白（haptoglobin, Hp）、炎症生物标志物S100A12和腺苷脱氨酶（adenosine deaminase, ADA）、氧化应激标志物总抗氧化能力（total antioxidant capacity, TAC）、总氧化状态（total oxidant status, TOS）及氧化应激指数（oxidative stress index, OSI）、总免疫球蛋白G（immunoglobulin G, IgG），并通过定量聚合酶链反应（quantitative polymerase chain reaction, qPCR）检测多种病原体。结果显示，接种疫苗的仔猪对支原体属（Mesomycoplasma）病原体的阳性率较低，同时炎症和免疫反应生物标志物水平较低。尽管两组间的发病率和死亡率无显著差异，但接种组仔猪的个体体重略高、死亡率略低。判别函数分析显示，唾液生物标志物和病原检测结果能够以87.2%的正确率区分健康与患病仔猪。研究表明，唾液生物标志物作为一种非侵入性工具，可用于监测口服ETEC F4/F18疫苗接种期间仔猪的健康状况，并可能反映疫苗对整体健康状态的改善作用。

论文解读：基于唾液生物标志物监测断奶后仔猪口服ETEC F4/F18疫苗期间的健康状况

一、研究背景与目的

断奶是猪生产中最为关键的阶段之一，仔猪在此时期经历从液态母乳向固态饲料的转变，伴随肠道生理和微生物群的剧烈变化，易出现代谢活动下降、养分吸收不良和肠道疾病易感性增加。多种应激源（如与母猪分离、混群、日粮突变）可导致采食量减少、体重下降及腹泻风险升高，进而造成死亡或生产性能下降。产肠毒素大肠杆菌（ETEC）是引起新生仔猪、断奶前和断奶后腹泻的主要病原，给养猪业带来重大经济损失。仔猪在断奶后母源抗体水平下降，自身免疫系统尚未完全成熟，疫苗免疫成为常见防控手段，但病原流行受空气质量、生物安全、遗传、抗菌药物使用及饲养方案等多因素影响，选择有效的免疫方案并不容易。因此，开发能够反映胃肠道功能状态和整体健康水平的生物标志物具有重要意义。

唾液作为一种非侵入性、易于采集的生物样本，已用于量化应激（如α-淀粉酶、皮质醇）、炎症或免疫反应（如CRP、Hp、ADA、S100A12、IgG）及氧化状态（TAC、TOS、OSI）等生物标志物。此前已有研究在粪便、血清和肠道组织中监测仔猪口服ETEC疫苗后的体液和细胞免疫反应，但利用唾液分析监测猪ETEC疫苗接种后健康状况的研究目前非常有限。本研究的假设是，唾液生物标志物能够在野外条件下区分健康与患病动物，并能评估疫苗接种后的免疫激活状态，表现为免疫生物标志物升高以及病原阳性率降低。研究目的是通过检测免疫激活、炎症状态、氧化应激相关唾液生物标志物，结合生产性能和多种病原检测，监测口服ETEC F4/F18疫苗后仔猪的健康状况。

二、研究方法概述

本研究在西班牙东南部一家商业化保育猪场开展，共纳入3,776头28日龄以上的杜洛克×（长白×大白）断奶仔猪，其中50%为雄性、50%为雌性。仔猪在断奶前已按常规免疫程序接种猪圆环病毒2型（PCV-2）和支原体肺炎疫苗。到达保育场后，1,888头仔猪经口服途径接种商业改良活疫苗Coliprotec? F4/F18（VAC组），另1,888头不接种（CONTROL组）。两组分别饲养于不同房间，并采取严格的生物安全措施以防止疫苗株传播。唾液样本采集自137头仔猪，包括基线样本10头、CONTROL组63头和VAC组64头，分别于接种后2周、4周和7周（wpv）采样，并同步记录个体体重和临床状态。唾液样本用于检测急性期蛋白（CRP、Hp）、炎症标志物（S100A12、ADA）、氧化应激指标（TAC、TOS、OSI）、总IgG，并通过qPCR检测多种病原体（包括猪肺炎支原体、猪鼻支原体、PCV-2、猪链球菌、A型轮状病毒、产气荚膜梭菌以及猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSv和A型流感病毒SwIAV）。统计分析包括双因素/三因素方差分析、卡方检验、t检验、偏相关分析、判别函数分析以及Kaplan-Meier生存分析。

三、主要研究结果

3.1 仔猪生产性能

每周发病率在两组间相似，均低于20%，最高发病水平出现在接种后第5周（CONTROL组17.21%，VAC组18.75%）。总死亡率在CONTROL组（4.61%）略高于VAC组（4.13%），但差异不显著。Kaplan-Meier分析显示，两组在无病存活概率上无显著差异，但从第3周起VAC组存活概率略高于CONTROL组，研究结束时VAC组存活概率为97%，CONTROL组为95%。健康与患病仔猪的体重在两组间均无统计学显著差异，但VAC组仔猪在多数时间点和健康状态下平均体重略高。VAC组健康与患病动物之间的效应量（Cohen's d）在4-wpv和7-wpv时略小于CONTROL组。全期平均日增重（ADG）为CONTROL组0.320 kg/d、VAC组0.296 kg/d；采食量分别为0.540 kg/头/天和0.449 kg/头/天。

3.2 唾液生物标志物

在健康仔猪中，2-wpv时CONTROL组IgG浓度显著高于VAC组。CRP（VAC组）、Hp、ADA和IgG（两组）在不同时间点有统计学差异：CRP和Hp在4-wpv升高，ADA和S100A12在7-wpv升高，IgG在2-wpv最高后逐渐下降至7-wpv最低。氧化应激标志物无明显变化。在健康和患病仔猪比较中，患病动物CRP、ADA、S100A12和IgG总体较高：CONTROL组患病仔猪在2-wpv和7-wpv时CRP显著高于健康仔猪；CONTROL组患病仔猪在7-wpv时ADA显著升高；CONTROL组患病仔猪在2-wpv时S100A12显著高于健康仔猪；VAC组患病仔猪在7-wpv时IgG显著高于健康仔猪。接种疫苗的患病仔猪S100A12水平在所有时间点均略低于未接种的患病仔猪。氧化应激标志物（TAC、TOS、OSI）无显著组间差异，但患病CONTROL仔猪在2-wpv和4-wpv呈现略高的TAC和TOS趋势。

3.3 病原检测

基线样本中除轮状病毒A（全阴性）外，其余病原均被检出。M. hyorhinis在2、4、7-wpv的阳性率分别为88.4%、85.7%、83.3%，CONTROL组（87.3%）略高于VAC组（84.4%），健康和患病动物阳性率几乎相同。PCV-2阳性率在2-wpv为72.1%，4-wpv达100%，7-wpv为97.6%；患病动物（98.4%）比健康动物（81%）更易阳性。S. suis在所有样本和时间点均为100%阳性，健康VAC仔猪在2-wpv时Ct值低于健康CONTROL（即DNA载量更高），但在4-wpv时相反。M. hyopneumoniae在7-wpv时阳性率最高（28.6%），VAC组总阳性率（9.4%）低于CONTROL组（12.7%）。C. perfringens阳性率随时间逐步增加（2-wpv 20.9%、4-wpv 28.6%、7-wpv 35.7%），VAC组（32.8%）高于CONTROL组（23.8%）。PRRSv在2-wpv时所有样本池均阳性，之后阳性率下降，患病动物阳性率（91.7%）显著高于健康动物（33%，p = 0.036），且患病动物Ct值显著更低（p = 0.01）。SwIAV阳性率很低，无组间差异。

3.4 参数间相关性

唾液生物标志物与病原Ct值之间存在多种显著相关。S. suis与Hp、TAC正相关；PCV-2与TAC、IgG正相关；体重与ADA正相关；多个唾液生物标志物之间存在正相关，尤其是ADA与S100A12、TAC、TOS，TOS与TAC、Hp，Hp与CRP等。阴性相关包括M. hyorhinis Ct与Hp、S. suis Ct与ADA、M. hyopneumoniae Ct与IgG。分时间点分析显示，4-wpv时M. hyorhinis Ct与CRP、Hp负相关，C. perfringens Ct与TOS负相关；7-wpv时M. hyorhinis Ct与Hp、ADA负相关，但不再与CRP相关，IgG与其他生物标志物的相关性随时间增强。

3.5 判别函数分析

使用所有数据区分CONTROL与VAC样本时，Wilks' lambda不显著（p = 0.238），正确分配率为62.4%。而以健康状态（健康/患病）作为解释变量时，无论是否按组或时间点分段，Wilks' lambda均为p < 0.001，总体正确分配率达87.2%。CONTROL组正确区分健康与患病动物的比例为91%，VAC组为84.7%。分时间点分析中，除VAC组7-wpv外（p = 0.129），其余各时间点的判别均显著。

四、讨论与结论总结

本研究结果表明，尽管口服ETEC F4/F18疫苗接种未显著改变仔猪发病率和死亡率，但接种组表现出数值上更低的死亡率和更高的存活概率，以及略高的个体体重，提示疫苗具有一定的全身保护作用。未接种的患病仔猪表现出更强烈的急性期炎症反应，涉及CRP、S100A12（早期）和ADA（后期）；接种疫苗的仔猪整体炎症和免疫激活标志物水平较低，提示疫苗可能通过诱导肠道黏膜特异性抗体而改善动物免疫状态。患病仔猪IgG水平普遍高于健康仔猪，反映疾病状态下免疫激活增强；但接种组患病仔猪IgG低于未接种组，可能表明疫苗增强了动物应对多种病原暴露的能力。氧化应激指标未显示显著组间差异，可能是机体抗氧化系统足以维持氧化-抗氧化平衡。病原检测方面，接种组对M. hyorhinis和M. hyopneumoniae的阳性率数值较低，而对C. perfringens阳性率较高，但后者未伴随临床疾病加重，可能与肠道菌群竞争性排斥有关。PRRSv感染可能是患病仔猪临床表现的主要病因之一。判别函数分析证明，唾液生物标志物结合qPCR病原检测能够有效区分健康与患病动物，是评估猪群健康状态的可靠工具。

研究结论指出：在两个研究组中，基于唾液生物标志物能够准确对仔猪健康状况进行分类。口服ETEC疫苗与略高的个体体重和数值上更低的死亡率相关，但差异无统计学显著性。接种仔猪的CRP、ADA、S100A12和IgG水平较低，表明急性期反应和炎症反应较弱，免疫系统激活程度降低。接种仔猪对支原体属病原体阳性率较低；尽管其他病原（如C. perfringens）检出率较高，但IgG水平低于未接种仔猪，可能反映了其对病原暴露具有更好的应对能力。