具有超小胚胎样干细胞（VSEL）样特征的人类脐带血来源细胞群体的无饲养层扩增及其早期心肌定向分化

《Differentiation》：Feeder-Free Expansion and Early Cardiomyogenic Commitment of a Human Umbilical Cord Blood-Derived Cell Population with Very Small Embryonic-Like Stem Cell (VSEL)-Like Features

　　

•无饲养层、无血清培养实现了hUCB-VSEL样细胞的高效扩增•与WJ-MSC相比，VSEL样细胞呈现出心脏/中胚层预分化特征•序贯性5-AZA/TGFβ1刺激促进了早期心肌细胞方向分化•心脏诱导后，在第10天分化阶段GATA4、NKX2.5、TNNI3/cTnI和TNNT2/cTnT上调•碱性磷酸酶（ALP）阳性的类胚胎体结构支持了扩增细胞的胚胎样特性

引言

心肌梗死（MI）后心力衰竭仍是全球疾病负担和死亡的主要原因之一。尽管药理学和介入策略取得了进展，缺血性损伤后心肌细胞的不可逆丧失仍是一个重大的未解决挑战，这主要归因于成年心脏有限的再生能力[1]。因此，干细胞疗法已成为心肌修复的有前景的策略[2]，而支架生物材料被认为可以改善细胞滞留并减少不良心脏重塑[3]。

已有多种干细胞群被研究用于心脏再生应用；然而，每种细胞都存在重要局限性。骨髓来源干细胞（BM-SCs）需要侵入性采集程序，且其再生潜力随供者年龄增长而下降[4]。胚胎干细胞（ESCs）和诱导多能干细胞（iPSCs）具有广泛的分化潜能，但与道德争议、基因组不稳定性、畸胎瘤形成以及潜在的免疫排斥相关[5, 6, 7]。间充质干细胞（MSCs）虽然能够向心肌细胞方向分化，但在临床转化中面临重要障碍，包括移植后植床效率不足和长期存活力差[8]。总体而言，这些局限性凸显了寻找具有更好临床适用性的替代干细胞来源的必要性。

极小胚胎样干细胞（VSELs）最近被描述为一种罕见的非造血细胞群，具有多能性相关特征，已从未多种组织和物种中分离出来[9, 10, 11, 12]。Kucia等[13]首次鉴定了成年小鼠骨髓中具有多能干细胞特征的罕见细胞群。VSELs的特征包括：体积微小（3–5 μm）、核质比高、共表达多能性标志物（OCT4、NANOG、SSEA、REX1）和造血相关标志物（CD133+、CD34+、CXCR4+）、能够形成胚胎体（EBs），以及在不形成畸胎瘤的情况下向所有三个胚层分化的潜能[7, 9, 13, 14, 15]。急性心肌梗死后，VSELs被动员至外周血并归巢至缺血心肌，发挥心肌保护作用[1, 16, 17]。尽管VSELs的生物学特性和分离可重复性仍是持续研究的课题[18]，但独立研究组已报告在人脐血中存在表达CXCR4+/Lin?/CD45?多能性标志物的细胞群[19, 20]。关于心脏分化，Wojakowski等[17]证明骨髓来源的VSELs可在体外分化为表达GATA4、MLC2v和心肌肌钙蛋白T（cTnT）的心肌样细胞。此外，相关的原始非造血干细胞群已被证明可表达心脏相关蛋白，包括GATA4、β-MHC、α-肌节肌动蛋白和cTnT，以及通过膜片钳分析评估的功能性离子电流[21]。

人脐血（hUCB）是VSEL样细胞最具可及性和临床相关性的来源之一。与外周血或骨髓相比，hUCB作为VSEL来源具有实际优势，包括非侵入性采集和适用于转化应用的人源属性，尽管不同供者之间的细胞产量可能存在较大差异[12, 22, 23, 24, 25]。

然而，hUCB-VSEL样细胞也存在重要的实用和转化局限性。其在单个脐血单位中丰度极低、供者间细胞回收变异性以及体外扩增策略标准化程度仍然有限，这些都构成了可重复性分离和规模化的重要障碍[7, 12, 18, 26]。此外，如果最终考虑将hUCB来源的VSEL样细胞用于同种异体输注，则需系统评估供受者免疫相容性。在成熟的同种异体脐血移植中，细胞剂量和HLA匹配都是移植物选择的重要决定因素[27, 28]。然而，针对VSEL样细胞产品的相应组织相容性要求尚未明确定义。因此，在考虑其潜在优势的同时，也应注意到仍存在大量有待解决的生物学和技术挑战。

该细胞群本身的身份也存在争议。独立研究组报道，根据已发表标准从hUCB中分离的细胞缺乏功能性干细胞特征[18]，在成年小鼠中也有类似发现[29]。该争论于2012年至2014年间主要发生，涉及流式细胞术检测限附近事件识别的方法学差异，详细论述见其他文献[14]。此后，协调统一的分离策略[30]和单细胞转录组表征[31]已解决了其中一些问题。该问题仍未定论，因此本文中研究的细胞群始终被标注为VSEL样细胞。

虽然hUCB-VSELs向造血、间充质和神经谱系的分化潜力已有报道[20, 22]，但其心肌细胞方向分化潜能尚未被系统探索。为弥补这一空白，我们采用了5-氮杂胞苷（5-AZA）联合转化生长因子β1（TGFβ1）。5-AZA是一种成熟的DNA甲基转移酶（DNMT）抑制剂，可促进DNA低甲基化，从而增强多种干细胞类型的细胞可塑性、增殖和心肌细胞方向分化[32]。随后应用TGFβ1以进一步促进心脏中胚层规格化和成熟[33]。

本研究描述了一种三步体外方案，用于分离、体外扩增和早期心肌细胞方向分化一种小规模、非造血性、脐血来源的细胞群，该细胞群此前被本课题组表征为VSEL样细胞[20]。我们证明，hUCB-VSEL样细胞在扩增后仍保留全部四种多能性相关标志物的可检测表达，尽管其相对水平发生转变，且与Wharton's Jelly来源的间充质干细胞（WJ-MSCs）相比，展现出与心脏/中胚层谱系预分化一致的转录特征。此外，我们证明这些细胞发生了与早期心肌细胞方向分化一致的转录和形态学变化，表现为心脏转录因子和肌钙蛋白上调、类胚胎体结构形成以及获得心肌细胞样形态。

章节片段

人脐血VSEL样细胞的分离

在获得母亲书面知情同意后，使用密闭采集袋系统，通过穿刺脐静脉在胎盘剥离前采集脐血样本。研究方案经亚里士多德大学医学院生物伦理委员会批准（方案编号：8.705/25-05-2021），并遵循世界医学协会《赫尔辛基宣言》原则。已获取书面知情同意。

CD34、CD45和CD184/CXCR4表达的定性流式细胞术评估

对新鲜分离的脐血来源细胞群进行序贯流式细胞术门控分析，在100,000个采集事件中鉴定出53个CD34+事件。在CD34+门控内，极少量事件呈现CD45?/CD184+表型，与VSEL样免疫表型相符。代表性图谱见图中图3。鉴于最终门控内事件数量极少且分析性质为定性，这些发现被解读为支持该细胞存在性

讨论

本研究描述了一种三步体外模型，用于hUCB-VSEL样细胞的分离、体外扩增和早期心肌细胞方向分化。我们的结果表明，hUCB-VSEL样细胞可在无饲养层条件下扩增，在保留多能性相关标志物表达的同时其表达水平发生改变，与WJ-MSCs相比展现出独特的转录特征，并且在序贯5-AZA和TGFβ1刺激后可诱导向心肌样细胞方向分化。

局限性

应承认存在若干局限性。首先，新鲜脐血样本的可用性和质量是主要实际制约因素，因为VSEL样细胞的产量和活力取决于采集后24–48小时内快速处理，且不同样本间起始细胞数量存在较大差异，反映了稀有干细胞群操作固有的挑战。

其次，心肌细胞方向分化主要通过分子和形态学分析进行评估。尽管

结论

本研究基于转录和形态学证据，支持hUCB来源VSEL样细胞在无饲养层5-AZA/TGFβ1条件下进行早期心肌细胞方向分化，但尚需进一步的蛋白水平及功能学验证。扩增后的VSEL样细胞保留了全部四种多能性相关标志物的表达，尽管其相对水平发生显著转变，表明扩增条件未能维持起始细胞的自我更新能力。基线

生成式人工智能使用声明

在本工作准备过程中，作者使用了"Claude by Anthropic"和"ChatGPT"以改善语言和可读性。使用工具后，作者对内容进行了审查和编辑，并对发表文章的内容承担全部责任。

作者贡献声明

Eleni Gounari：撰写—审阅与编辑、撰写—初稿、可视化、方法学、调查、形式分析、数据管理、概念构思。Electra Papameletiou：撰写—审阅与编辑、调查、形式分析。Aliki Iliadou：撰写—审阅与编辑、撰写—初稿、可视化、资源、方法学、调查、形式分析、数据管理、概念构思。Dimitrios N Bikiaris：撰写—审阅与编辑、监督。George Koliakos：

数据声明

支持本研究结果的数据可向通讯作者申请获取。

资助

本研究未获得外部资助。Biohellenika S.A. 通过设施和设备耗材提供了实物支持。

利益冲突声明

George Koliakos任职于Biohellenika生物技术公司。Biohellenika S.A. 为本研究的执行提供了设施和设备耗材。作者声明不存在其他利益冲突。

致谢

作者感谢Biohellenika S.A. 生物技术公司授权使用其设施并提供本研究所需的耗材。我们感谢亚里士多德大学医学院副教授Maria Papaioannou（生物化学）提供的宝贵科学输入和技术支持。我们感谢Argiro Niti和Vasileios Geropoulos在生物学和统计学方面的有益讨论。

Aliki Iliadou|Eleni Gounari|Electra Papameletiou|Michalis Aivaliotis|Dimitrios N. Bikiaris|George Koliakos