理性设计一种羧酸酯酶激活的近红外荧光探针，实现药物性肝损伤的高效成像

《Dyes and Pigments》：Rational design of a carboxylesterases activatable near-infrared fluorogenic probe enables efficient imaging drug-induced liver injury

　　

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  通过结合多维筛选，确立了一种理性设计策略。
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  筛选出的探针 DCM-F-Bz 对羧酸酯酶表现出快速动力学响应（7.5 秒）。
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  DCM-F-Bz 表现出固有的内质网靶向能力。
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  DCM-F-Bz 能够监测对乙酰氨基酚（APAP）诱导的肝损伤模型中羧酸酯酶的动力学变化。

引言

肝脏是维持稳态和调节生理功能的关键解毒和代谢器官 [1], [2]。然而，来自外源性毒素和内源性代谢物的各种威胁可能导致肝功能不全，并进一步发展为急性肝损伤 [3], [4]。近年来，外源性毒素和内源性代谢物引起的各种肝损伤会加剧肝毒性的现象在医学领域受到了广泛关注 [5], [6]。特别是，药物性肝损伤（DILI）越来越被认为是急性肝损伤的重要原因，其特征是无潜在肝脏疾病的患者肝细胞功能迅速丧失^[7]。因此，实时监测 DILI 的严重程度对于有效评估给药安全性至关重要。目前，DILI 的标准诊断方法包括监测丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）等 [8], [9]。然而，这些参数容易受到肌肉、心脏和肾脏损伤的影响，且无法区分 DILI 的严重程度 [10], [11]，导致诊断结果不准确。为了应对这些挑战，迫切需要开发用于高效 DILI 评估的非侵入性诊断方法。

羧酸酯酶（CE）可水解内源性和外源性酯、酰胺和硫酯 [12], [13]。在哺乳动物中，CE 主要分为 CE1 和 CE2 亚型^[14]。作为一种在人和其他哺乳动物肝细胞中分布丰富的内质网驻留蛋白，CE 在脂质代谢和能量稳态中起着至关重要的作用^[15]。特别是，其调节与各种肝脏疾病密切相关，并在 DILI 进展过程中表现出明显的肝脏特异性 [16], [17]。这使得 CE 成为早期 DILI 诊断的潜在生物标志物，同时调节 CE 可能为 CE 相关肝病提供新的治疗方法 [18], [19]。目前，比色法、Western blotting 和高效液相色谱等常用方法在体外 CE 检测中占据主导地位 [20], [21]。然而，这些方法受限于其不适合实时生物成像应用。考虑到其高灵敏度、易于操作和实时监测等显著优势 [22], [23]，荧光探针在酶活性检测方面受到了越来越多的关注。尽管在监测生理过程中的 CE 活性方面取得了巨大进展，但这些探针通常受限于发射波长较短和非酶促自发水解。因此，仍然迫切需要具有合适动力学特性和增强灵敏度的新型荧光探针，以便在复杂生物环境中高效实时获取 CE 水平。

由于具有非侵入性和优异的空间分辨率，光学成像与荧光探针的结合已成为时空追踪生物标志物和评估各种生理进展不可或缺的模态 [24], [25]。特别是，在近红外（NIR）区域发射的可激活探针因其抑制的自发荧光、深层组织渗透性和增强的信噪比 [26], [27]，在活体系统的生物成像和诊断中引起了广泛关注。迄今为止，二氰基异佛尔酮荧光团因其大的斯托克斯位移、优异的光稳定性和高的摩尔消光系数，被广泛应用于 NIR 生物成像。鉴于这些优点，开发了一系列基于二氰基异佛尔酮的探针，用于 CE 的特异性成像和疾病诊断 [28], [29]。尽管获得了令人鼓舞的结果，但关键挑战在于实现高选择性。现有利用羧酸酯作为识别基团的探针也可能与乙酰胆碱酯酶（AChE）和丁酰胆碱酯酶（BChE）相互作用^[30]。此外，更快的反应时间和在生理环境中更好的溶解度对于成像 CE 相关疾病是理想的^[31]。因此，迫切需要开发一种具有高度特异性和快速响应的新型 NIR 探针，专门用于复杂生物环境中的 CE 成像。

在此，我们通过整合分子对接和实验验证，使用理性的探针设计策略开发了一种用于 CE 的高性能 NIR 荧光探针。基于二氰基异佛尔酮荧光团的理化性质和 CE 底物偏好，构建了一个源自二氰基异佛尔酮荧光团的候选探针库，以确定合适的发光支架（方案 1a）。光谱测定和分子对接证实，酚 - 二氰基异佛尔酮荧光团对 CE 表现出显著的荧光增强和优异的结合亲和力。通过依次优化识别基团和氟取代基，一种新型 NIR 荧光探针 DCM-F-Bz 展现了对 CE 优异的传感性能。得益于快速动力学响应和内质网靶向能力，筛选出的探针 DCM-F-Bz 可有效实时监测活细胞和对乙酰氨基酚（APAP）诱导的肝损伤小鼠中内源性 CE 的波动（方案 1b）。

章节摘要

试剂和仪器

异佛尔酮、谷胱甘肽、4-羟基苯甲醛、葡萄糖氧化酶和 CE 购自阿拉丁（上海）化工有限公司。丙二腈、6-羟基 -2- 萘甲醛、2-噻吩甲酰氯、苯甲酰氯、乙酸、丙烯酰氯、乙酰胆碱酯酶（AchE）和丁酰胆碱酯酶（BchE）购自上海麦克林生化科技有限公司。3-(4,5-二甲基噻唑 -2- 基)-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT）和对乙酰氨基酚（APAP）购自

寻找 CE 激活荧光探针的最佳支架

为了开发对 CE 具有高特异性的荧光探针，基于两种二氰基异佛尔酮衍生物荧光团（DCM 和 HDM）和四种结构不同的 CE 响应基团，设计并合成了八种候选探针（图 1a）。通过¹H NMR、¹³C NMR 和 HRMS 的综合表征，确认了 DCM-R 和 HDM-R 的成功合成（支持信息）。加入 CE 后，基于 DCM 的探针显示出优异的荧光增强（10 – 36

结论

总之，通过荧光团支架、识别基团和 F- 取代基的结构优化，使用理性策略开发了一种用于 CE 的高性能荧光探针。经过这些结构优化，DCM-F-Bz 被鉴定为用于 CE 的高性能荧光探针。正如预期，开启型 DCM-F-Bz 作为 CE 特异性荧光探针，在生物 pH 范围内表现出快速响应（7.5s）、高灵敏度（0.015 U/mL）。此外，

CRediT 作者贡献声明

Ruqi Zhang: 撰写 – 初稿，可视化，验证，方法论，调查，形式分析，数据整理。Mengshuang Lu: 撰写 – 初稿，方法论，调查，形式分析，数据整理。Haimei Yang: 撰写 – 审阅与编辑，撰写 – 初稿，验证，方法论，资金获取，概念构思。Yanting Song: 撰写 – 审阅与编辑，验证，资金获取，形式分析。Jianan Huang: 验证，方法论，数据

备注

作者声明不存在竞争性财务利益。

利益冲突声明

作者声明他们没有任何已知的竞争性财务利益或个人关系，这些关系可能影响本论文中报告的工作。

致谢

这项工作得到了中国国家自然科学基金委员会（82504737）、海南省自然科学基金（224QN179）和海南大学基础研究基金（KYQD(ZR)-22008）的支持。

Ruqi Zhang|Mengshuang Lu|Jianan Huang|Sijie Chen|Yanting Song|Haimei Yang