《Fitoterapia》：Candidate bioactive flavonoids and an optimized combination from
Abelmoschus manihot (L.) flower with effects on high-glucose-associated and renal injury phenotypes in zebrafish
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•AMF对高糖相关表型和肾损伤表型表现出最显著的效果。•优先筛选出八种候选生物活性黄酮，其中6号组合显示出最佳的整体响应。•AMF的作用可能涉及炎症、葡萄糖代谢、AGE-RAGE及MAPK相关过程。引言糖尿病肾病（DN）是糖尿病最常见且最具破坏性的微血管并发症之一，是慢性肾脏
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AMF对高糖相关表型和肾损伤表型表现出最显著的效果。
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优先筛选出八种候选生物活性黄酮，其中6号组合显示出最佳的整体响应。
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AMF的作用可能涉及炎症、葡萄糖代谢、AGE-RAGE及MAPK相关过程。
引言
糖尿病肾病（DN）是糖尿病最常见且最具破坏性的微血管并发症之一，是慢性肾脏病（CKD）和终末期肾病（ESRD）的主要原因[1]、[2]。约30%–40%的糖尿病患者最终会发展出不同程度的肾损伤[3]，主要表现为持续性蛋白尿和肾小球滤过率（GFR）下降。在晚期阶段，DN可能进展为不可逆的肾衰竭，并显著增加心血管事件和全因死亡的风险[4]、[5]。尽管标准疗法近期取得进展，但DN患者的残余肾脏风险仍然很高，这突显了开发能够多组分、多靶点协同调控疾病相关病理过程的新干预策略的重要性[6]、[7]。
从机制角度看，DN是一个由多种因素驱动的复杂病理过程，包括慢性高血糖、胰岛素抵抗、炎症反应的持续激活，以及晚期糖基化终末产物（AGEs）的积累及其受体——晚期糖基化终末产物受体（RAGE）的激活[8]、[9]。AGE-RAGE轴的持续激活可进一步激活ERK1/2和p38 MAPK等下游信号通路，从而促进肾脏结构损伤和纤维化[10]。近期研究已确定炎症是DN发病和进展的关键驱动因素[11]。同时，白蛋白尿和GFR等传统指标可能无法及时全面反映早期肾小管损伤，而肾损伤分子-1（Kim-1）是近端肾小管上皮损伤的敏感标志物，与肾功能下降和疾病进展密切相关[12]。因此，基于葡萄糖代谢指标、肌酐（Cr）、Kim-1和肾脏形态学表型的综合评价，可能为候选药物的调糖和肾保护效应提供互补信息[13]。
Abelmoschus manihot（L.）Medik.（AM）是一种重要的传统民族药物和常见的中药材资源。其干花具有悠久的药用历史。《中华人民共和国药典》将干花列为法定药用部位，记载其功能为清热利湿、解毒消肿，并收录慢性肾炎为适应证[14]。《本草纲目》进一步记载其花"治淋"且"消肿毒"、"治丹毒"、"消肿"、"散血"、"止血"、"生肌"、"敛疮"等[15]，支持其在与排尿困难和水肿相关病症中的传统用途。植物化学比较显示，花冠中多种生物活性成分的含量显著高于AM的根、茎、叶和种子，且花冠与其他植物部分之间存在显著的成分差异[16]。从民族药理学角度看，比较不同植物部分的疗效并阐明花具有肾保护作用的物质基础，对于验证花作为优先药用部位至关重要。
现代化学和药理学研究表明，AMF的主要生物活性物质为黄酮类化合物，包括槲皮素-3-O-β-D-槐糖苷（超氧化物歧化酶样）、异槲皮苷、芦丁、槲皮素和山奈酚[17]。以AM花总黄酮（AMF）为主要成分开发的黄葵胶囊已在中国临床用于治疗DN[18]。AMF制剂和黄酮类成分（如槲皮素-3-O-β-D-槐糖苷）已被证明可减少蛋白尿、改善肾功能指标，并减轻肾脏炎症和结构损伤。这些发现表明，AMF的药理作用可能涉及多种生物过程，包括炎症反应、代谢紊乱和AGE-RAGE相关信号通路[19]。
尽管已有研究基础，但仍存在若干空白。现有研究高度集中于AMF及其总黄酮，对AM的茎、根和种子的系统性比较不足[20]。此外，与调糖和肾保护效应相关的具体生物活性成分及其优化组合尚不明确。连接化学成分、疗效指标和靶点的逻辑链尚未完全建立。对于民族医药现代化而言，有必要确定花为何比其他植物部分表现出更显著和一致的药理效果，以及这些成分如何共同贡献于观察到的效果。
谱效关系研究为解决这些问题提供了有用的策略。通过将高效液相色谱（HPLC）指纹图谱与药效学指标相关联，该策略可筛选与药理活性相关的色谱峰[21]、[22]、[23]。灰色关联分析（GRA）特别适用于草药研究中"多组分—多指标"的场景，并已被广泛应用于将指纹峰与多种药理效应相关联的天然产物研究[24]。此外，均匀设计法可用于多组分组合的高效优化和评价[25]。
基于上述背景，本研究系统比较了AM的四个部分（花、茎、根和种子）在不同提取溶剂下的安全性和生物活性。采用两种独立的斑马鱼模型：高糖诱导模型用于评估糖代谢相关表型，马兜铃酸A诱导的肾损伤模型用于评估肾损伤相关表型。我们评估了葡萄糖（GLU）、2-(N-(7-硝基苯并-2-噁唑-1,3-二唑-4-基)氨基)-2-脱氧葡萄糖（2-NBDG）摄取、Cr、Kim-1、肾水肿率，并通过H&E染色进行了肾组织病理学评价。在确定表现出最显著和一致药理效果的植物部分、提取物及提取方法后，我们将HPLC指纹图谱与灰色关联分析及熵权法相结合，筛选候选生物活性成分，并使用均匀设计法进行配比优化，在所测试的实验条件下将优化组合与AMF-95进行比较。采用网络药理学和分子对接预测潜在的成分-靶点-通路关系，并通过全幼体qRT-PCR为所选预测提供初步的转录层面支持。本研究旨在为AMF的优先药用提供科学依据，并鉴定具有对高糖相关和肾损伤表型作用效果的候选生物活性黄酮及优化组合。
各节摘要
化学试剂与材料
AM由马鞍山市通兴药业有限公司（中国安徽）提供。异槲皮苷、芦丁、山奈酚、山奈酚-3′-O-β-D-葡萄糖苷（M3′G）和锦带花素-8-O-葡萄糖醛酸苷（G8G）购自成都艾博克生物科技有限公司（中国成都）。槲皮素-3-O-β-D-槐糖苷和槲皮素购自四川微克奇生物科技有限公司（中国四川）。马兜铃酸（AA）和槲皮素-3′-O-葡萄糖苷（Q3′G）购自成都普实生物科技有限公司（中国成都）。
不同溶剂提取的不同部位AM提取物的安全性评价
为了确定使用不同溶剂从AM不同部位获得的提取物的安全浓度范围，首先在斑马鱼幼体中进行了急性毒性试验。结果表明，所测试提取物的毒性存在显著差异，花的水提物在所测试提取物中表现出最低的表面毒性（图2A–D）。根据24 h急性毒性曲线，不同植物部位提取物的最大耐受浓度（MTC）和半数致死浓度（LC??）值
讨论
基于两种独立的斑马鱼模型——高糖相关代谢紊乱模型和肾损伤模型，本研究系统评价了使用不同溶剂制备的AM不同部位提取物的安全性和药理学活性。结果表明，花提取物对糖相关和肾损伤相关指标表现出更显著和一致的效果，而茎、根和种子的提取物则产生相对较弱或
结论
本研究系统评价了AM的不同部位及其提取物，表明在所测试的植物部位中，花提取物对高糖相关和肾损伤相关表型产生的效果最为显著和一致。其中，AMF-95显示出最显著的疗效，这很可能归因于其相对高丰度的黄酮类化合物富集。通过灰色关联分析结合独立药理学评价和均匀设计优化，筛选出八种候选
CRediT作者贡献声明
岳冠云：初稿撰写、验证、方法学、调查、形式分析、数据管理、概念化。张梦元：可视化、调查。徐伟龙：撰写——审阅与编辑。李飞：撰写——审阅与编辑。
伦理声明
本研究遵循ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。本研究获得中国药科大学动物伦理委员会批准。（批准号：2024-10-091）。
关于写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明
在本工作的准备过程中，作者仅使用ChatGPT进行语言润色。使用该工具后，作者根据需要审阅和编辑了文本。科学内容和解释由作者本人负责。
利益冲突声明
作者声明，他们没有已知的相互竞争的经济利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
致谢
本研究得到国家重点研发计划（编号：2023YFC3504404）、国家自然科学基金（编号：82322072、82675216、82205025）、中央高校基本科研业务费（编号：2632025TD06）、新疆维吾尔自治区重点研发计划（编号：2023B03012-1）和江苏省自然科学基金（编号：BK20251967）的资助。
岳冠云|张梦元|徐伟龙|李飞
