疣足中一种新型岩藻糖基化硫酸乙酰肝素的结构表征与修饰——来自疣足螺 *Volutharpa ampullacea perryi*

《Food Chemistry》：Structural characterization and modification of a novel fucosylated heparan sulfate from the pleopods of whelk Volutharpa ampullacea perryi

　　

摘要

全球水产加工行业产生大量未被充分利用的海洋副产品，既造成环境负担，也迫切需要可持续的资源化策略。海洋来源的多糖类作为功能性食品原料具有独特的结构特征。本文报道了一种从Volutharpa ampullacea perryi颚足中分离的新型岩藻糖基化HS（VpHS）的可扩展提取、结构表征和功能性评价。通过优化的分离过程和分析，我们证明VpHS具有高度硫酸化的肝素样骨架（GlcNS/6S-GlcA2S）。关键的是，每九个二糖单元中有一个在GlcA的O-3位上连接着4-O-硫酸化的α-L-岩藻糖残基。VpHS的抗凝活性远低于肝素，而酶促6-O-和3-O-硫酸化使其抗凝活性显著提升（>300%），表明其具有适合功能性食品应用的良好安全性。本研究为将海洋副产品转化为高附加值多糖提供了可持续途径，并为功能性食品的开发提供了结构和理论基础。

引言

全球水产加工行业每年产生大量未被充分利用的海洋副产品，这不仅造成环境负担，也导致潜在高价值资源的严重损失（Lal等，2024；Rebou?as等，2023）。在循环蓝色生物经济的背景下，将这些低价值海洋残余物转化为功能性生物材料已成为一项紧迫的任务。在各种资源化策略中，从海洋加工废弃物中提取和再利用生物活性多糖具有特别的前景，因为这些生物聚合物通常具有独特的结构特征和与健康相关的生物活性。与此同时，流行病学和临床研究已确立了饮食习惯与血栓性疾病风险之间的密切联系，血栓性疾病是全球发病率和死亡率的主要原因之一（Jin等，2025）。因此，鉴定具有良好抗凝特性的食品来源生物活性多糖已成为心血管事件一级预防策略中备受关注的发展方向。这一双重挑战——减少海洋废弃物同时开发可持续的健康促进食品原料——为从此前被忽视的海洋物种中探索新型糖胺聚糖（GAG）样多糖提供了研究依据。

GAGs是由重复二糖构建单元组成的酸性线性多糖，带有高度负电荷（Sasarman等，2016）。根据单体单元类型、连接模式和硫酸化程度，GAGs分为四类：硫酸软骨素（CS）/硫酸皮肤素（DS）、肝素（Hep）/硫酸类肝素（HS）、透明质酸（HA）和硫酸角质素（KS）（Volpi等，2025）。在GAGs中，Hep/HS结构最为异质且硫酸化程度最高。HS和Hep具有相同的多糖骨架（β-D-葡萄糖醛酸（GlcA）/α-L-艾杜糖醛酸（IdoA）和α-N-乙酰-D-葡萄糖胺（GlcNAc）），其复杂的生物合成过程在内质网和高尔基体网络中通过多种酶的协同作用发生，包括糖基转移酶、硫酸基转移酶和C5-差向异构酶（Greco等，2025；Li & Kusche-Gullberg，2016；Rabenstein，2002）。骨架经历可变修饰过程，包括由N-脱乙酰酶/N-硫酸基转移酶将GlcNAc残基N-脱乙酰/N-硫酸化形成N-硫酸葡萄糖胺（GlcNS），这决定了HS链的总体设计（Sheng等，2011），随后由C5-差向异构酶将部分GlcA残基转化为IdoA残基，然后分别由醛糖2-O-硫酸基转移酶、6-O-硫酸基转移酶和3-O-硫酸基转移酶介导O-硫酸化（Kusche-Gullberg & Kjellén，2003；Mernie & Zaia，2025；Singh等，2026；Sugaya等，2008）。

Hep和HS具有相似的二糖骨架，但在硫酸化程度、分布和生物学功能上存在差异，使其成为开发抗凝食品原料的候选物（Rabenstein，2002；Sarrazin等，2011；Shi & Zhang，2026）。HS广泛存在于细胞表面和细胞外基质中，在那里调控信号传导和细胞发育。其动态结构修饰与炎症、感染和肿瘤发生密切相关（Nadanaka & Kitagawa，2026；Xu等，2008；Zhou等，2011）。相比之下，来源于哺乳动物组织的Hep硫酸化程度更高，其众所周知的抗凝活性依赖于特定的五糖基基序（Guerrini等，2013；A. Onishi等，2016；Beurskens等，2020）。然而，动物来源的Hep引发了安全和伦理方面的担忧，且其强抗凝作用限制了其在功能性食品等非临床应用中的使用。因此，人们越来越关注从可持续的海洋副产品中发现具有温和抗凝特性、适合心血管健康促进的新型HS样多糖。

海洋环境的生物多样性为发现结构独特和功能多样的Hep/HS多糖提供了丰富的资源库，这些多糖具有作为抗凝食品原料的潜力。先前的研究已鉴定出海鞘动物中具有高抗血栓特性的肝素样多糖，可能对心血管健康有益（J. C. Santos等，2007；Belmiro等，2009；Abreu等，2019；Teixeira & Pav?o，2022），以及虾蟹中表现出抗炎、纤溶和低抗凝活性的类肝素多糖，凸显了其作为功能性食品原料的潜力（Andrade等，2013；Brito等，2008，Brito等，2014；Chavante等，2014；J. Chen等，2023；Chen等，2022）。此外，海洋双壳类生物富含含有非常规二糖单元的Hep/HS多糖，其中一些表现出强效抗凝作用且具有良好的安全性，适合膳食应用（Cesaretti等，2004；G. Chen等，2022；Du等，2020；Gomes等，2010；Jordan & Marcum，1986；Z. Liu等，2022；Luppi等，2005；Nader & Dietrich，1987；S. Onishi等，2023；Qin等，2024）。值得注意的是，研究人员最近从扇贝Patinopecten yessoensis中分离出一种岩藻糖基化硫酸类肝素（HS），该多糖表现出抗凝和促进神经突起生长的活性（Onishi等，2023）。然而，其结构表征仍不完整，具体的岩藻糖基化位点和硫酸化模式尚未阐明。

Volutharpa ampullacea perryi（Volutharpa属，因其颚足形态与鲍鱼足相似而俗称"假鲍鱼"）是一种深海腹足纲软体动物。其体表覆盖着丰富的黏液。该物种仅分布于中国北部黄海和渤海地区，属于冷水性海洋物种。然而，关于该物种的生物学研究及生物活性成分调查仍十分匮乏，长期以来一直被视为低价值贝类，深度开发潜力有限。不断积累的研究报道了从该物种中分离生物活性物质，包括抗癌蛋白、ACE抑制肽和抗氧化肽，突显了其高价值利用的潜力（He等，2019；Wang等，2015；Wang等，2022）。本研究从海螺Volutharpa ampullacea perryi的颚足中纯化出一种岩藻糖基化、高度硫酸化的HS样多糖（VpHS）。重要的是，我们通过单糖分析、酶解消化、NMR、MS和HPLC技术表征了VpHS的岩藻糖基化位点和模式，揭示了VpHS的骨架由GlcA2S-GlcNS(±6S)组成，4-O-硫酸化岩藻糖残基连接在GlcA的O-3位。随后使用人源3-O-硫酸基转移酶和小鼠6-O-硫酸基转移酶进行的酶促修饰显著增强了其抗凝活性。有趣的是，我们从同一物种开发了一种具有强效抗结肠炎活性的硫酸化葡聚糖（Chen等，2025），本研究鉴定了一种低抗凝活性的岩藻糖基化HS，并提出硫酸化重塑作为优化海洋来源Hep/HS前体作为温和抗凝食品原料的策略。这些发现拓展了从海洋副产品中提取的HS作为具有潜在心血管健康益处的功能性食品组分的应用。

章节摘要

材料与试剂

Volutharpa成体标本购自青岛码头，立即分离颚足。软骨素酶（CSase）ABC（EC 4.2.2.4）、肝素酶（Hepase）I（EC 4.2.2.7，>50 IU/mg）、II（EC 4.2.2.-，>20 IU/mg）和III（EC 4.2.2.8，>100 IU/mg）来自Flavobacterium heparinum，Hep/HS标准品来自猪肠黏膜（Hep标准品纯度：>99%；HS标准品纯度：>95%）由GlycoSciTech有限公司（中国济南）提供。来自牛气管的CSA（95%

VpHS的分离与纯化

经充分蛋白水解后，用5%三氯乙酸脱蛋白并用乙醇沉淀，获得粗GAGs（14.6 g），产率为干颚足粉（200 g）的7.3%。随后，将粗GAGs（0.5 g）在DEAE-纤维素柱（15 × 300 mm）上进行阴离子交换层析（图S1）。DEAE-纤维素柱用50 mM NaH₂PO₄含阶梯式NaCl溶液（0–1.5 M）进行洗脱。洗脱液的咔唑反应分析（图1A）确定了主要

结论

本研究从海螺Volutharpa ampullacea perryi的颚足中分离出HS样多糖VpHS，产率为0.196%（1.96 mg/g干颚足）。结构分析揭示VpHS为岩藻糖基化多糖，主要由双硫酸化二糖（63.8%）和三硫酸化二糖（30.5%）组成，硫酸与二糖比率与Hep标准品相当。值得注意的是，VpHS的抗凝活性远低于Hep，表明其具有良好的安全性，

CRediT作者贡献声明

Yong Qin：撰写—初稿，可视化，验证，软件，资源，调查，形式分析，数据整理，概念构思。Xu Wang：调查，形式分析。Junchen Zhang：软件，概念构思。Yiling Chen：调查。Haixin Yi：调查。Xiaoyu Cui：数据整理。Ruiqing Cheng：方法论。Naihan Han：方法论。Xiangyu Xu：形式分析。Wenshuang Wang：撰写—审阅与编辑，可视化，验证，资金支持。Fuchuan

未引用参考文献

Billings和Pacifici，2015

Liu和Thorp，2002

Parish，2005

Peng等，2021

利益冲突声明

作者声明不存在已知的可能影响本文所述工作的竞争性经济利益或个人关系。

致谢

本工作得到国家重点研发计划（编号：2024YFC2816005）、国家自然科学基金（编号：32571485、31971201和31800665）、山东省重点研发计划（竞争性创新平台）（编号：2025CXPT145）、山东省自然科学基金（编号：ZR2024MD015和ZR2023MC017）以及微生物技术国家重点实验室（山东大学）前沿与

Yong Qin|Xu Wang|Junchen Zhang|Yiling Chen|Haixin Yi|Xiaoyu Cui|Ruiqing Cheng|Naihan Han|Xiangyu Xu|Wenshuang Wang|Fuchuan Li