红藻（条斑松藻）蛋白质超声辅助酶解提取的顺序优化、部分纯化及表征

《Food Chemistry》：Sequential ultrasound-assisted enzymatic extraction optimization, partial purification, and characterization of proteins from red seaweed ( Gracilaria corticata)

　　

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  Gracilaria corticata（GC）可作为一种新型蛋白质替代来源。
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  采用超声辅助酶处理法从GC中提取蛋白质。
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  获得蛋白质得率为33.69%的超声辅助酶解蛋白提取物（UEPE）的最优条件为纤维素酶浓度4.40%、提取时间2.74 h、提取温度46.95 °C。
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  UEPE及其部分纯化组分具有独特的蛋白质谱、二级结构和生物活性。
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  UEPE具有潜在的营养和加工功能特性，有望增强其在食品领域的应用。

引言

鉴于对环境可持续性和人口增长的担忧，对高质量（理想氨基酸组成和消化率）替代蛋白质来源的需求稳步上升（Thiviya等，2022）。凭借潜在的健康益处和较高的蛋白质含量，红藻正在作为一种替代蛋白质来源崭露头角，与传统蛋白质来源形成对比（De Souza Celente等，2023）。全球已识别出约6500种红藻物种，在全球海藻市场（价值71亿美元）中发挥着至关重要的作用（Rawiwan等，2022）。全球红藻产量占1825万吨（湿重基础），其中Kappaphycus/Eucheuma spp.以1162万吨位居首位，Gracilaria spp.以363万吨紧随其后，其中97%为养殖品种（Janke，2024）。红藻被商业化用于水胶体生产，但作为蛋白质来源的开发利用仍然有限，尽管其蛋白质含量可达47%（干重基础）（Zhang等，2022）。此外，红藻富含生物活性蛋白质，如藻胆蛋白（>50%）、RuBisCO蛋白和凝集素，具有抗氧化、抗糖尿病、抗高血压和抗肥胖特性（Inumala、Kudre和Kudre，2026）。此外，与传统植物来源相比，红藻是铁的丰富来源（73–3490 μg/g），其必需氨基酸含量为42.0–51.2%，与酪蛋白和卵白蛋白等动物蛋白相当（Flores等，2015；Vieira等，2018）。此外，红藻蛋白以其良好的消化率和加工功能特性著称，凸显了其作为替代蛋白原料的潜力（Idowu等，2025；Wong和Cheung，2001）。

尽管具有这些优势，但仅少数物种，如Palmaria和Porphyra，在蛋白质提取方面得到了广泛研究（De Souza Celente等，2023；Harrysson等，2018）。Gracilaria corticata是印度海岸线广泛分布的一个物种，其蛋白质含量约为15–23%，主要用于琼脂提取，产生大量生物质废弃物（Inumala、Kudre和Kudre，2026；Sushri等，2023）。利用这些生物质可以为提取有价值的蛋白质铺平道路。由于本研究主要关注从完整海藻生物质中优化蛋白质提取，未来需要进一步开发利用加工后的琼脂废弃物，以充分利用生物质。值得注意的是，由于红藻具有坚硬的细胞壁基质，其中含有复杂的多糖和多酚，限制蛋白质的释放，因此从红藻中高效提取蛋白质仍然具有挑战性（De Souza Celente等，2023）。因此，传统提取方法的蛋白质回收率相对较低（7.81–19.6%），且存在诸多局限性，包括提取时间长（16–24 h）、选择性低以及依赖不可持续的化学品（De Souza Celente等，2023；Kumar等，2014；Rathod等，2026）。

为了克服这些不足，已探索了几种新兴的提取技术，包括超声处理、酶提取和超临界流体提取（Rathod等，2026）。这些技术各自基于不同的原理来破坏海藻细胞壁，且因物种而异。例如，Braspaiboon等（2022）采用超声辅助碱法从五种不同的藻类中提取蛋白质，从Arthrospira platensis中获得81.86%的蛋白质得率。然而，同样的提取方法在其他藻类中未显示令人满意的结果，Porphyra tendera、Laminaria japonica和Undaria pinnatifida的蛋白质得率均低于30%。这表明有必要对蛋白质含量丰富且供应充足的海藻的蛋白质提取工艺进行优化，而这一领域尚未得到充分探索。然而，已有报道称超临界流体提取对非极性化合物（如类胡萝卜素、脂肪酸和叶绿素）的提取更具选择性，这可能限制其在从海藻中提取蛋白质方面的有效性（Maciassanchez等，2009；Quitério等，2022）。

超声处理通过机械破坏海藻复杂的细胞壁，将蛋白质和其他生物活性化合物释放到溶液中，从而促进蛋白质提取（Braspaiboon等，2022）。此外，已有研究探讨了使用纤维素酶、木聚糖酶、角叉菜胶酶和琼脂酶等多糖酶来改善红藻的细胞破壁，因为红藻的细胞壁主要由纤维素、木聚糖、角叉菜胶和琼脂组成（De Souza Celente等，2023；Rathod等，2026）。然而，酶的效果取决于海藻细胞壁的组成，而不同物种之间差异较大。由于纤维素酶具有易获得性和特异性，其主要被用于从红藻中提取蛋白质（De Souza Celente等，2023）。此外，超声处理与酶辅助提取相结合，显示出比单独使用任何一种方法更有效的细胞壁降解效果。研究表明，超声与酶的联合使用显著提高了蛋白质提取得率，这可能归因于超声产生的空化效应促进了酶对细胞壁的接触，随后增加了蛋白质的释放（Bozdemir等，2022；Rathod等，2026）。迄今为止，尚无关于从Gracilaria corticata中优化超声辅助酶解蛋白质提取条件的研究。因此，本研究主要聚焦于采用顺序超声辅助酶解（纤维素酶）提取法对Gracilaria corticata中的蛋白质进行优化和表征。该顺序策略包括超声预处理与酶解蛋白质提取相结合，是一种具有前景的方法，与常规方法相比，可将蛋白质得率提高约20–50%，同时缩短提取时间高达50%，而提取时间长正是海藻蛋白加工中的一个关键局限（Dhayalan和Phanumartwiwath，2025；Inumala、Kudre和Kudre，2026）。例如，Elizondo Sada等（2026）报道称，在提取时间为137.2 min时，将超声与Viscozyme联合使用，Palmaria palmata的蛋白质提取得率从4%提高到35%。另一项研究表明，与传统提取方法相比，超声处理可将提取时间从6 h缩短至1 h，强调了其在破坏海藻细胞壁中的作用（Gómez Barrio等，2022）。此外，对纯化蛋白质的表征可为其结构和化学性质提供有价值的见解。这些发现可能有助于开发高价值的富蛋白食品原料，并促进蓝色经济的发展。

节选

化学试剂

本研究中使用的化学试剂均为分析纯。牛血清白蛋白（BSA）、2,4,6-三(2-吡啶基)-s-三嗪（TPTZ）、邻苯二甲醛（OPA；超纯AR，99%；CAS编号：643-79-8）、Folin-Ciocalteau试剂（FCR）、2,2-二苯基-1-苦基肼、β-巯基乙醇（β-ME）、p-硝基苯酚丁酸酯（PNPB）、N，N，N'，N'-四甲基乙二胺（TEMED）、Trolox、溴酚蓝和甲醇（HPLC级）均购自印度Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd.（SRL）。

GCP的近红外成分分析

GCP的近红外成分分析结果见表4。GC的水分含量为4.32 ± 0.09%，蛋白质含量为12.20 ± 0.10%，脂肪含量为0.65 ± 0.13%，碳水化合物含量为70.10 ± 0.93%，灰分含量为11.76 ± 0.95%。这表明GC富含碳水化合物，其次是蛋白质和灰分。已有研究报告Gracilaria spp.的水分、蛋白质、脂肪、碳水化合物和灰分含量分别为8.40–19.04%、10.86–25.29%、0.19–7.07%和42.73–63.13%（Rasyid等，2019；Rosemary等

结论

本研究发现，超声辅助酶解蛋白质提取法是一种有效的方法，可以提高Gracilaria corticata的蛋白质得率，同时缩短提取过程，而提取时间长一直是海藻蛋白行业面临的重大挑战。所有自变量对蛋白质得率（%）均有显著影响，在纤维素酶浓度为4.40%、提取时间为2.74 h、提取温度为46.95 °C时蛋白质得率最高。

作者贡献声明（CRediT）

Chandini Inumala：撰写——初稿、方法论、调查、形式化分析、数据管理。Suhana Maheen：撰写——初稿、方法论。Tanaji G. Kudre：撰写——审阅与编辑、可视化、验证、监督、资源获取、项目管理、资金筹集、概念构思。

资金支持

本研究由印度迈索尔印度科学与工业研究委员会中央食品技术研究所在提供资金支持（MLP 0314（wp1）、GAP000681）。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文所报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

致谢

作者感谢印度新德里大学拨款委员会授予的UGC-JRF奖学金。作者衷心感谢印度泰米尔纳德邦曼达帕姆区域中心中央海洋渔业研究所在职N. Ramamoorthy先生（退休技术员）在海藻采集过程中提供的悉心协助。

Chandini Inumala|Suhana Maheen|Tanaji G. Kudre