冷冻处理影响蜜环菌代谢组特征并增强其体外细胞毒性

《Food Chemistry Advances》：Freezing affects the metabolomic profile of Armillaria mellea and is associated with increased in vitro cytotoxicity

　　

摘要 蜜环菌（Armillaria mellea (Vahl) P. Kumm.）是一种被广泛食用并在传统医学中应用的蘑菇。然而，其食用常与胃肠道中毒相关，尤其是在烹饪不当时。本研究采用非靶向代谢组学方法，探究加工方式对蜜环菌代谢物谱的依赖性改变及其与体外细胞毒性的关联。研究人员对经不同加工方式处理的子实体（生鲜、水煮、冷冻、先煮后冻、先冻后煮20分钟或40分钟）进行了比较。多变量分析显示，水煮与冷冻样品之间存在显著区分，其中非极性组分的化学变异性贡献最大（总方差64.9%）。基于Caco-2细胞的体外实验显示出显著的加工依赖性细胞毒性，冷冻样品的提取物在1 μg/mL浓度下使细胞活力显著降低41.75%。研究人员共推定注释了76种判别性代谢物，主要为脂质衍生化合物，如氧化脂质（oxylipins）、脂肪醛、脂肪酰胺及有机氮代谢物。总体而言，研究结果表明加工方式显著影响代谢组学特征及体外细胞毒性，同时强调需要进一步研究以确定候选代谢物在生理条件下的因果作用、生物利用度及毒理学相关性。

蜜环菌加工方式与体外细胞毒性关联的代谢组学研究解读

一、研究背景与科学问题

蜜环菌（Armillaria mellea (Vahl) P. Kumm.），又称蜂蜜蘑菇，是一种兼具营养价值和药用潜力的食用担子菌。其子实体含约65.47%碳水化合物、24.47%蛋白质和2.10%脂质，其多糖具有免疫调节和抗氧化活性，并产生包括蜜环菌内酯（melleolides）在内的多种萜类、酚类和甾醇类生物活性化合物。然而，尽管蜜环菌被多个国家列为合法贸易食用菌，其食用却频繁与胃肠道中毒事件相关。在意大利，蜜环菌占1998至2017年报告的所有蘑菇相关中毒事件的约21%；瑞士在1995至2009年间报告了40例；坎帕尼亚地区2018至2022年间相关中毒病例占比达22%至55%。中毒症状通常在摄入后数小时内出现，包括恶心、呕吐、腹痛和腹泻。

现有认知认为其毒性源于热不稳定且水溶性的化合物，沸水烹煮15至20分钟并弃去烹饪水可使蘑菇安全食用。然而，冷冻后再烹饪与持续性毒性相关，提示冷藏可能稳定或改变某些有毒代谢物。尽管溶血素曾被提出为潜在毒剂，但其作用仍存争议。目前，不同加工方式引起的化学变化尚未被充分表征。基于此，本研究采用核磁共振（NMR）与液相色谱-高分辨质谱（LC-HRMS）联用的非靶向代谢组学方法，系统探究加工方式对蜜环菌代谢物谱的影响及其与Caco-2细胞毒性的关联。

二、研究设计与技术方法

研究人员于2023年10月在意大利南部贝内文托省Cautano的单一采样点采集蜜环菌子实体，采样区为以土耳其栎、鹅耳枥、柔毛栎和欧洲栗为主的混交林。研究人员从六株不同的活体欧洲栗树上采集六个菌丛（每丛约10至40个子实体），仅限该寄主物种以降低生长基质相关变异性。经形态学鉴定后，将六个菌丛的子实体合并混合为复合样品，再分为六个处理组：生鲜（R）、水煮（B）、先煮后冻（BF）、冷冻（F）、先冻后煮20分钟（FB20）和先冻后煮40分钟（FB40）。冷冻处理模拟家用静态冷冻条件（-20°C，48小时），水煮处理遵循意大利地区官方推荐方案（沸水100°C，20或40分钟，弃去烹饪水）。

主要技术方法包括：1H-NMR代谢组学分析（600 MHz，对极性和非极性提取物分别进行检测）、LC-HRMS/MS非靶向代谢组学分析（正离子模式，m/z 100-2000，分辨率60000）、基于Caco-2人结肠癌细胞模型的MTT体外细胞活力检测、主成分分析（PCA）与正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）多变量统计、火山图分析、层次聚类分析（HCA）及Spearman秩相关分析。

三、研究结果

3.1 NMR分析结果

1H-NMR谱图显示极性提取物中存在常见初级代谢物，包括氨基酸（缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸）、碳水化合物和糖醇（α-和β-葡萄糖、海藻糖、甘露醇）、有机酸（琥珀酸、苹果酸）、核苷（腺苷和鸟苷）、胆碱和甘油。非极性谱图中检测到脂肪酸特征信号（末端甲基、酰链亚甲基、α-和β-位氢、烯丙基氢）、二酰甘油双双重峰及多不饱和脂肪酸信号。初步谱图分析显示处理间差异在非极性组分中更为显著，冷冻样品在5.5-7.5 ppm及9.7 ppm（醛基特征）区域出现信号。PCA分析中，非极性相解释总方差64.9%（PC1占43.1%），形成两个明确聚类：冷冻样品与煮制样品，生鲜样品呈中间分布。

3.2 提取物对细胞活力的影响

MTT实验结果表明加工方式显著影响蜜环菌提取物的细胞毒性特征。煮制样品细胞毒性最低，冷冻样品诱导Caco-2细胞活力最大程度降低。在24小时处理下，F、FB20和FB40提取物在500 μg/mL最高浓度下分别将细胞活力降至29.88%、26.25%和24.63%。48小时后，冷冻蘑菇提取物活性最强，在1 μg/mL浓度下即将活力降至41.75%，该显著效应在两个独立实验（n=8）中一致观察到。生鲜样品呈中等趋势，在500 μg/mL浓度下24小时和48小时后活力分别降至40.38%和25.13%。FB20和FB40处理的细胞毒性特征更接近冷冻样品。煮制处理降低了提取物的细胞毒性潜力，而冷冻保存或产生了对肠上皮细胞作用更强的组分。

3.3 LC-HRMS分析结果

LC-HRMS分析在所有实验组中检测到蜜环菌属特征代谢物，包括蜜环菌内酯B（melleolide B，m/z [M+H]? 433.2199，RT 23.42）、armillaramide（m/z [M+H]? 556.5305，RT 37.26）、麦角钙化醇和麦角固醇（m/z [M+H]? 397.3466，RT 31.43和33.37）及7-氧脱氢松香酸（m/z [M+H]? 315.1957，RT 22.83）。脂肪酸谱以C18链为主（油酸C18:1、亚油酸C18:2、亚麻酸C18:3和十八碳四烯酸C18:4），约占脂肪酸总量60%，其次为棕榈油酸（C16:1），C20和C22脂肪酸仅占约5%。

OPLS-DA模型表现出优异的拟合度和预测能力（R2X=0.972，R2Y=0.997，Q2=0.995），经200次置换检验验证无过拟合。对正离子模式检测的11488个特征进行层次聚类分析，显示冷冻样品（F）与煮制样品（B）明确分离，且F与生鲜样品（R）的关联性较B更密切。火山图分析突出显示冷冻样品中1126个上调特征。共442个离子被选为煮制与冷冻组间的判别性特征（VIP>1且校正p<0.05），其中76种代谢物经精确质量、同位素模式及MS/MS碎裂分析获得推定注释。

判别代谢物主要属于脂质类分子和有机杂原子化合物。与煮制样品相比，冷冻样品中上调最显著的代谢物类别为有机磷化合物（占26%）、有机氮化合物（20%）和脂肪酰胺（13%）。然而，有机磷化合物在生鲜样品中含量最高，而生鲜提取物的细胞毒性低于冷冻提取物，提示该类代谢物单独难以解释观察到的细胞活力差异。相反，有机氮化合物（包括脂肪酰胺和内酯）、氧化脂质、聚酮类和倍半萜在冷冻样品中丰度最高，其次为生鲜样品，这一趋势与Caco-2细胞体外细胞毒性基本平行。

Spearman秩相关分析显示多种代谢物与细胞活力呈负相关，主要包括脂质衍生代谢物（氧化脂质和脂肪醛）、脂肪酰胺及含氮代谢物。与细胞毒性负相关的化合物包括PGF2α乙醇酰胺、PGD2乙醇酰胺、N-神经酰甘氨酸、N-神经酰天冬氨酸、N-油酰谷氨酸及若干N-酰基高丝氨酸内酯。氧化脂质中，13S-HODTA、12-酮基-十八碳三烯酸、16-HOTE、9-KOT、10,11-环氧-7Z-十六碳烯酸、12-羟基-十七碳二烯酸和2-羟基亚麻酸均与细胞活力呈负相关。12-氧代植物二烯酸（12-OPDA，m/z 293.2113）和茉莉酸（JA）在冷冻样品中丰度较高且与细胞活力负相关。

NMR分析提供了补充证据：冷冻和生鲜样品在7.43和7.41 ppm处显示双重峰信号（J=15 Hz），确认存在共轭脂肪酸衍生物，推定注释为9-氧代-ODE、9,14-二氧代-10,12-十八碳二烯酸、porrigenic acid、12-酮基-十八碳三烯酸、9-KOT和cibaric acid。其中cibaric acid已知在损伤的鸡油菌子实体中经酶促缓慢形成（约15分钟后达峰浓度），并在100°C水中加热10分钟降解。porrigenic acid此前从另一种食用担子菌Pleurocybella porrigens中提取，对人骨髓瘤THP-1细胞显示谱系特异性细胞毒性（IC??=46.5 μg/mL）。NMR谱中9.69 ppm的醛基信号可能对应脂质衍生醛类，包括8,11-十七碳二烯醛或氧化脂质进一步氧化产物如4-羟基-2E-壬烯醛，后者是研究最深入的脂质过氧化产物之一，以其反应性和细胞毒性著称。8,11-十七碳二烯醛与Caco-2细胞活力呈负相关。

四、讨论与结论

研究证实家用加工方式显著影响蜜环菌非极性提取物的代谢组学特征和体外生物活性。水煮降低了Caco-2细胞中观察到的细胞毒性效应，而冷冻与更强的细胞活力降低相关。冷冻后水煮（FB20和FB40）处理的细胞毒性特征更接近冷冻样品而非煮制样品，表明冷冻诱导的化学改变可能部分抵抗后续热处理的降解作用。冷冻可能通过冰晶形成破坏细胞区室化，增加膜脂与氧化反应的接触，从而促进氧化脂质等脂质氧化产物的积累。

研究共推定注释76种判别性代谢物，主要为脂质衍生化合物，包括氧化脂质、脂肪醛、脂肪酰胺和含氮代谢物。多种推定注释化合物的相对丰度与体外细胞毒性相关，提示其为未来毒理学研究的候选代谢物。然而，这些关联不建立因果关系，需通过靶向分离、细胞内蓄积、生物利用度和功能验证等进一步研究评估其贡献。研究存在若干局限性：基质效应无法完全排除，需使用真实标准和多种同位素标记内标进行靶向定量验证；结果仅针对本研究所用的家用静态冷冻条件，不应推广至速冻、鼓风冷冻或控速冷冻方案；尽管非极性组分因加工依赖性化学变异性最大而被选择，但极性代谢物的可能贡献及极性与非极性化合物间的协同效应无法排除。

综上，本研究证明加工方式显著影响蜜环菌的代谢组学特征和体外生物活性，强调了食品加工在决定蘑菇来源产品生物学特性中的重要性，同时需进一步研究以确立这些效应在生理条件下的毒理学和营养学意义。