利用代谢工程与发酵过程优化在大肠杆菌W3110中高产原儿茶酸

《Food Bioscience》：High-yield production of protocatechuic acid in Escherichia coli W3110 using metabolic engineering and fermentation process optimization

　　通过关键基因qsuB表达优化，PCA滴度提高了1.56倍。通过增强aroG表达并减弱aroE表达，PCA滴度提高了3.96倍。通过补料分批发酵优化（DO、RG），PCA滴度提高了13.29倍。在大肠杆菌中提供了PCA合成的高产生产工艺（32.58 g/L）。**引言**植物来源的天然产物凭借其多样化的生理功能，在人类健康保健中发挥着越来越重要的作用。对羟基苯甲酸（protocatechuic acid，PCA）作为一种具有代表性的植物来源天然产物，拥有多种珍贵的生物活性，包括抗氧化、抗菌、抗肿瘤和抗衰老等作用（Cai et al., 2024; Xu et al., 2026）。此外，它还是香兰素和没食子酸生物合成的关键前体（Kunjapur & Prather, 2019; Wang et al., 2025），因此被广泛应用于食品、保健产品和制药行业。例如，在食品领域，它可以用于制造保质期延长剂、食品防腐剂和食品风味添加剂（Li et al., 2023）。目前，对羟基苯甲酸的高产生物合成引起了广泛关注。尽管从植物中传统溶剂提取对羟基苯甲酸的方法较为常见，但由于产率低下（例如从山胡椒果实中提取的产率为10.81 μg/g），其工业应用受到限制（Li et al., 2019）。目前，工业上对羟基苯甲酸的生产主要依赖于通过没食子酸羟基化的化学合成方法，然而该方法存在一些缺点，包括使用危险化学品（如盐酸）以及需要高温反应条件（250°C），导致环境污染和能耗成本高昂（Antony & Wasewar, 2019）。与植物提取和化学合成相比，微生物生物合成为对羟基苯甲酸的生产提供了一种更加环保和高效的过程。近年来，借助合成生物学工具箱和代谢工程手段，多种微生物底盘细胞，包括谷氨酸棒杆菌（Kogure et al., 2021）、解脂假单胞菌（Chen et al., 2024）、大肠杆菌（Wang et al., 2024）、地衣芽孢杆菌（Rao et al., 2025）和酿酒酵母（Zhang et al., 2021），已成功被改造为细胞工厂，用于对羟基苯甲酸的高效内源或异源生物合成。在早期研究中，研究人员主要通过多种代谢工程策略对谷氨酸棒杆菌和解脂假单胞菌底盘进行改造，例如敲除或减弱竞争性代谢途径、增强前体供应以及优化关键酶（3-去氢莽草酸脱氢酶）的表达水平（Chen et al., 2024; Kogure et al., 2021），从而将碳通量重新定向至对羟基苯甲酸，实现有效的内源生物合成。例如，Li等人通过增加aroG^opt、aroQ和aroB基因的拷贝数，并利用蛋白质降解标签下调aroE基因的表达水平，在解脂假单胞菌KT2440中构建工程菌，所得重组菌株KGVA05在摇瓶培养中产生13.2 g/L的对羟基苯甲酸，经过72小时补料分批发酵后在15 L生物反应器中达到38.8 g/L（Li et al., 2023）。随着合成生物学的发展，研究人员最近尝试将经典模式生物（酿酒酵母和大肠杆菌）作为新一代底盘细胞，通过异源构建和优化对羟基苯甲酸生物合成途径来高效合成对羟基苯甲酸。例如，Zhang等人通过系统性代谢工程改造酿酒酵母，建立了从木质素到对羟基苯甲酸生物合成的生物漏斗途径，对羟基苯甲酸滴度达到0.81 g/L（Zhang et al., 2021）。Liu等人筛选并对大肠杆菌JD7中的3-去氢莽草酸脱羧酶Qa-4进行分子工程改造，获得了一株优良突变体Qa-4^{W169F/F311Y/A27M}，并结合加速适应性进化策略，所得重组菌株P7在摇瓶发酵中产生5.6 g/L的对羟基苯甲酸，经过36小时补料分批发酵后在5 L生物反应器中达到26.7 g/L（Liu et al., 2026）。这些结果表明，大肠杆菌可以作为异源高效合成对羟基苯甲酸的优良底盘。凭借其良好的遗传背景、成熟的基因编辑和调控工具箱、较低的发酵成本以及快速生长等特点，大肠杆菌已成为合成生物学和生物制造领域中最广泛使用的底盘微生物之一（Pan et al., 2026）。近年来，大肠杆菌已被成功应用于多种高附加值化学品的工业规模生产，通过系统性代谢工程和发酵工艺优化（Pan et al., 2026; Wan et al., 2026）。值得注意的是，大肠杆菌具有生产周期短和放大发酵过程中滴度显著提升的优势，例如与摇瓶水平相比，产品滴度分别提高了24.03倍（L-同型半胱氨酸：3.5→84.1 g/L）（Mu et al., 2021）、3.87倍（2'-岩藻糖基乳糖：32.1→124.25 g/L）（Wang, Zhang, Zhang, et al., 2026）和13.01倍（L-酪氨酸：7.11→92.5 g/L）（Ping et al., 2023）。这些报道表明，基于大肠杆菌的细胞工厂在环保生物制造中具有降低生产成本和提高生产效率的巨大潜力，并进一步暗示大肠杆菌可以作为高产对羟基苯甲酸生产的杰出细胞工厂。本研究采用大肠杆菌W3110作为底盘细胞。首先，通过异源表达和优化3-去氢莽草酸脱氢酶QsuB构建了异源对羟基苯甲酸生物合成途径。随后，我们通过aroG基因过表达增强合成途径，并通过下调aroE基因削弱竞争途径，以促进对羟基苯甲酸的合成，所得重组菌株WP5在摇瓶发酵中实现了2.28 g/L的对羟基苯甲酸滴度。最后，我们在10 L生物反应器中通过补料分批发酵成功实现了有效的对羟基苯甲酸生物合成，对羟基苯甲酸滴度达到32.58 g/L，较摇瓶水平提高了13.29倍（图1）。本研究建立了对羟基苯甲酸的高产生产工艺，并为对羟基苯甲酸的有效放大发酵生产提供了参考。**章节摘要****菌株、质粒和培养基**本研究中使用的菌株和质粒列于表S1。大肠杆菌DH5α作为载体构建的克隆菌株，大肠杆菌W3110作为对羟基苯甲酸合成的底盘菌株。质粒pTrc99A和pHY300PLK用于qsuB基因过表达载体构建（图S1），并应用CRISPR/Cas9系统进行基因整合和启动子替换。Ptrc启动子具有基础渗漏性表达，并驱动目标基因的转录。**对羟基苯甲酸生物合成途径的构建与表征**对羟基苯甲酸是一种具有显著应用价值和广阔市场前景的植物来源天然产物。目前，将微生物底盘细胞改造为细胞工厂是实现目标产品环保、高效生物制造的重要策略，而大肠杆菌是最受欢迎的细胞工厂构建底盘生物之一（Pan et al., 2026）。为构建高产合成对羟基苯甲酸的大肠杆菌细胞工厂，大肠杆菌……**结论**大肠杆菌W3110是一种优秀的底盘细胞，已被改造为微生物细胞工厂用于多种高附加值化合物的高产生产。本研究通过构建异源对羟基苯甲酸生物合成途径和代谢途径优化（包括增强合成途径和削弱竞争途径），构建了能够从头合成对羟基苯甲酸的重组菌株WP5。**CRediT作者贡献声明**Yi Rao： 写作——审阅与编辑，写作——初稿，软件，方法学，正式分析，数据整理。Rui Zhao： 验证，方法学。Liyuan Wei： 验证，正式分析。Junyan Liu： 调查，正式分析。Shihao Yan： 调查，数据整理。Xin Ma： 方法学，调查。Dongbo Cai： 写作——审阅与编辑，验证，资金获取。Shouwen Chen： 写作——审阅与编辑，项目管理，资金获取。**利益冲突声明**作者声明不存在任何已知可能影响本文所报告工作的经济利益或个人关系方面的竞争冲突。**致谢**本研究获得了以下项目的资助：国家自然科学基金（32300027）、湖北省科技创新人才计划（2024DJA022）、湖北省科技创新计划项目（2024BBB066）以及湖北省农业微生物产业发展重大项目（NYWSWZX2025-2027-08）。