《Food Chemistry: Molecular Sciences》：A detection tool for meat species classification and adulteration: validation and evaluation of a self-developed 12-species multiplex amplification and detection panel
编辑推荐：
肉类物种来源的准确测定对于食品真实性评估和质量控制至关重要。物种替代、错误标签及未申报成分可能导致经济损失、削弱消费者信心，并与宗教或伦理饮食要求相冲突。在绞碎或混合肉类产品中，物种鉴定尤为困难，因为加工过程消除了许多原本可用于视觉鉴别的形态学特征。能够在单次
肉类物种来源的准确测定对于食品真实性评估和质量控制至关重要。物种替代、错误标签及未申报成分可能导致经济损失、削弱消费者信心，并与宗教或伦理饮食要求相冲突。在绞碎或混合肉类产品中，物种鉴定尤为困难，因为加工过程消除了许多原本可用于视觉鉴别的形态学特征。能够在单次检测中筛查多种可疑动物物种的分析方法，有望提高实验室真实性评估的效率。
常规的物种来源测定方法包括形态学或组织学检查以及基于蛋白质的免疫分析（Fengou等，2021；Macedo-Silva等，2000；Nieuwoudt等，2016）。这些方法可为新鲜和保存良好的材料提供有用信息，但当诊断性组织结构被破坏或蛋白质变性时，其性能可能下降。基于DNA的方法提供了一种替代方案，因为遗传标记在适度加工或降解后仍可保持可检测性。然而，DNA对加工过程的普遍耐受性并不能证明每种基于DNA的检测方法都适用于加工食品。这种适用性必须使用代表性基质和加工条件通过实验加以验证。
线粒体DNA因其相对较高的细胞拷贝数以及兼具种内保守性与种间变异性的区域，被广泛用于动物物种鉴定。源自细胞色素c氧化酶亚基I、细胞色素b、NADH脱氢酶亚基1、12S核糖体RNA、ATP合酶亚基8以及D-loop区的标记已被应用于物种鉴定研究（Hebert, Cywinska等，2003；Hebert, Ratnasingham和DeWaard，2003；Natonk-Wisniewska和Krzyscin，2017）。然而，其分析性能取决于引物设计、靶序列保守性、DNA质量、样本组成以及PCR抑制剂的存在。短线粒体扩增子在DNA片段化时理论上可能具有优势，但在降解或加工样本中的性能不能仅凭扩增子长度推断。
可用的分子方法包括常规单重PCR、PCR-限制性片段长度多态性、实时PCR、DNA条形码测序以及多重PCR（Asing等，2016；Dell等，2021；Thanakiatkrai和Kitpipit，2017；Wu等，2018）。当怀疑的候选物种数量较少时，单重PCR操作简便，但当需要筛查多个预定义靶标时，可能需要进行多次独立反应。实时PCR提供灵敏的定量检测，但单次反应可容纳的靶标数量通常受可用荧光通道和检测设计限制。DNA条形码和测序更适合研究未知生物材料，但需要测序设施和额外的分析时间。多重PCR通过同时扩增多个物种特异性片段提供了一种靶向替代方案，从而减少了独立反应的数量以及相应的样本和试剂消耗（Ishida等，2018；Li等，2019；Qin等，2019；Shehata等，2017）。
将荧光标记的多重PCR与毛细管电泳相结合，可根据片段大小和荧光通道区分扩增片段。与常规凝胶电泳相比，毛细管电泳提供自动化信号采集和更高的分辨率，可区分长度相近的片段。此前有多重检测方法已成功检测多种牲畜、家禽或非清真物种，但其验证设计在靶标数量、样本基质、生物学重复、检测水平及非靶标物种纳入方面各不相同（Ahamad等，2017；Denyingyhot等，2022；Dolch等，2020）。部分已报道的检测方法在单一分析体系中覆盖的物种较少，而另一些则使用多重反应或实时PCR系统。增加靶标数量可能提高筛查覆盖率，但也增加了引物相互作用、信号不平衡和非特异性扩增的可能性。因此，更大的靶标体系本身并不证明具有更优的分析性能。
本研究聚焦于12个预定义靶标，包括10种牲畜或家禽物种——鸭、马、猪、鹅、鸡、牛、羊、兔、鹌鹑和鸽——以及大鼠和人DNA。纳入大鼠DNA作为与啮齿动物接触或污染相关的潜在外源靶标。纳入人DNA以检验人源DNA能否在同一多重系统中被检测。单独检测到人DNA不应被解释为卫生状况不佳的证据，因为其可能源于常规操作或实验室污染；任何实际评估都需要适当的对照和解释标准。所得检测方法是一个封闭的靶向筛查系统，无法鉴定其引物体系未涵盖的物种来源的动物源性材料。完全未知的物种更适合通过DNA条形码、测序或其他非靶向方法进行研究。
本研究假设，一组选定的物种特异性线粒体引物可在实验室条件下同时为所有12个预定义靶标产生可区分且可重复的信号。因此，研究开发了一种荧光多重PCR-毛细管电泳检测方法，并使用靶标物种的DNA样本进行评估。评估检查了所测靶标间的扩增情况、不同总DNA输入量下的检测能力以及初步的单实验室重复性。还分析了含有不同比例大鼠DNA的纯化大鼠-鸽DNA混合物，以确定在实验条件下可稳定检测到的最低测试比例。由于研究未评估物理肉类混合物、加工食品、降解样本或复杂食品基质，其范围仅限于预定义靶标体系的初步实验室验证。
论文解读
一、研究背景与意义
肉类产品中动物源性成分的准确鉴定是食品真实性评估和质量控制的核心环节。物种替代、标签错误以及未申报成分不仅会造成经济损失、损害消费者信任，还可能违反宗教或伦理饮食规范。在绞碎或混合肉类产品中，由于加工过程破坏了可用于视觉鉴别的形态学特征，物种鉴定尤为困难。能够在单次检测中同时筛查多种可疑动物物种的分析方法，可显著提高实验室真实性评估的效率。
现有物种鉴定方法各有局限。形态学和组织学检查以及基于蛋白质的免疫分析方法在新鲜和保存良好的材料中有效，但当组织结构被破坏或蛋白质变性后性能下降。DNA-based方法因遗传标记在适度加工或降解后仍可检测而具有优势，但并非所有DNA检测方法都适用于加工食品，必须通过代表性基质和加工条件的实验验证。线粒体DNA因其高拷贝数和兼具种内保守性与种间变异性的区域而被广泛使用，但其分析性能受引物设计、靶序列保守性、DNA质量、样本组成和PCR抑制剂等多因素影响。现有分子方法中，单重PCR在筛查多个靶标时需要多次反应，实时PCR受荧光通道数量限制，DNA条形码测序需要专门设施和额外时间。多重PCR可同时扩增多个物种特异性片段，减少反应数量和试剂消耗，但增加靶标数量也增加了引物相互作用、信号不平衡和非特异性扩增的风险。
本研究旨在开发并初步评估一个包含12个预定义靶标的多重PCR-毛细管电泳检测体系，涵盖鸭、马、猪、鹅、鸡、牛、羊、兔、鹌鹑、鸽10种牲畜或家禽物种，以及大鼠和人DNA。大鼠DNA作为啮齿动物接触或污染的潜在外源靶标，人DNA用于检验人源DNA能否在同一多重系统中被检测。研究假设选定的物种特异性线粒体引物可在实验室条件下同时产生可区分且可重复的信号，并通过系统的实验设计对该假设进行了验证。
二、研究设计与关键方法
研究人员从北京超市购买了鸭肉、马肉、猪肉、鸡肉、牛肉、羊肉、兔肉各20份以及鹅蛋、鹌鹑蛋、鸽蛋各20份作为DNA来源，从SPF（北京）生物技术有限公司获得20只6周龄SD大鼠（雌雄各10只），经颈脱臼安乐死后采集鼠尾组织，另从成年志愿者处采集20份人血液样本。动物实验经山西医科大学实验伦理审查委员会批准（批准号2025SGL51），人类血液采集获得书面知情同意。DNA提取使用QIAGEN DNeasy Blood and Tissue Kit，浓度测定使用Qubit 4荧光计，纯度评估使用NanoDrop OneC分光光度计，PCR扩增使用GeneAmp PCR System 9700热循环仪，片段分析使用3130xl Genetic Analyzer（Thermo Fisher Scientific）。
研究使用的主要关键技术方法包括：从GenBank数据库下载12种物种的mtDNA序列设计物种特异性引物，使用Primer 3软件设计引物、Primer-BLAST验证特异性、AutoDimer软件预测引物二聚体；采用荧光标记多重PCR结合毛细管电泳进行片段分离和检测，四种荧光染料（TAMRA、FAM、ROX、HEX）标记不同引物；通过连续调整引物浓度实现峰高平衡；使用12物种混合DNA模板进行灵敏度评估，使用纯化大鼠-鸽DNA混合物进行不同比例检测评估。
三、研究结果
3.1 多重扩增体系的构建
单重PCR扩增和后续多重优化使所有12个预定义物种均产生清晰的目标峰。基于每个靶标20份样本，毛细管电泳测定的片段大小分别为：鸭87.17±0.22 bp、马97.07±0.24 bp、猪107.03±0.04 bp、大鼠162.15±0.40 bp、鹅202.48±0.10 bp、鸡214.89±0.23 bp、牛220.83±0.12 bp、羊274.60±0.27 bp、兔297.26±0.08 bp、鹌鹑308.89±0.38 bp、鸽338.12±0.08 bp、人372.96±0.13 bp。观察到的片段大小分布使预定义靶标峰可在多重CE图谱中相互区分。
3.2 检测结果的物种特异性
使用12个预定义靶标物种的DNA对多重扩增体系进行评估，每个物种20份独立检测样本均产生预期的物种特异性PCR片段。在实验条件下，12个靶标物种间未观察到交叉扩增，阴性对照中未检测到靶标峰。结果表明成功扩增了预期靶标，且所测体系内无交叉扩增。由于未纳入近缘非靶标物种和其他常见食品物种，结果不应被解释为建立了全面的分析特异性。
3.3 不同总DNA输入量下的检测能力
使用总混合DNA输入量5 ng、1 ng和0.2 ng进行评估，每个输入水平进行三次独立PCR反应。在5 ng和1 ng总DNA输入量下，所有12个预定义靶标均在全部三次反应中被检测到，每个靶标的检出频率为3/3。在最低测试输入量0.2 ng下，12个靶标中有11个在全部三次反应中被检测到。鸡靶标产生相对较低但持续有效的荧光信号（87、64、91 RFU），均超过50 RFU阈值，判定为阳性。大鼠靶标产生138、21和18 RFU的信号，仅138 RFU峰超过阈值，另两个信号低于阈值判定为阴性，检出频率为1/3。因此，1 ng是本研究条件下所有12个靶标均稳定检出的最低总DNA输入量，但不应解释为正式的分析检测限。
3.4 检测结果的重复性
使用12物种混合DNA模板进行三次独立检测，在同一仪器平台上改变操作人员、实验日期、试剂批次和样本制备条件。三次检测均产生预期的12个靶标峰，片段大小保持在各自预定义范围内。12个靶标的峰高变异系数（CV）均低于10%，表明在所测实验室条件下信号响应相对一致。由于仅进行了三次检测且多个实验因素同时变化，各因素的单独贡献无法区分，结果应视为初步的实验室内部重复性评估。
3.5 不同比例混合基因组DNA模板的检测结果
使用纯化鸽和大鼠DNA制备含大鼠DNA质量分数50%、10%、5%、1%和0.1%的两物种混合基因组DNA模板，每次扩增总DNA输入量为10 ng。每个比例独立制备三批混合物，所有测试比例下鸽和大鼠靶标均在全部三批中被检测到。0.1%是本研究测试的最低大鼠DNA比例，由于未检测低于0.1%的浓度，此结果不应解释为正式检测限或等同于物理肉混合物中的同等性能。
3.6 分析评估总结
研究整合了靶标区分、不同DNA输入量下的检测、初步重复性和纯化大鼠-鸽DNA混合物检测结果。由于未纳入广泛的非靶标排除体系、正式检出概率分析、真实肉混合物、加工食品基质或实验室间验证，结果应解释为初步分析评估而非全面方法验证。
四、讨论与结论
讨论部分指出，本研究的核心贡献在于证明所选引物组可在所测条件下作为组合体系运行，12个靶标整合到单一反应中并可通过荧光标记和片段大小组合进行区分。线粒体DNA作为主要靶标来源，其挑战不仅在于使用线粒体标记，更在于将12个靶标整合到单一反应中同时保持可分离的荧光通道和片段大小分布。短扩增子可能有利于部分降解模板的扩增，但本研究未评估加工或降解食品样本，数据仅支持所测实验室条件下的分析行为。
大鼠靶标在0.2 ng输入量下表现出更高的信号丢失敏感性，而鸡靶标尽管荧光强度降低仍保持可检测。人DNA靶标需谨慎解读：阳性人DNA信号仅表明存在可扩增的人源物质，可能源于常规操作、环境接触或实验室过程，不能直接作为卫生状况不佳的证据。大鼠-鸽DNA混合物实验显示0.1%为最低测试比例，但DNA比例不能直接等同于肉质量比例，因为组织类型、DNA提取效率、线粒体拷贝数、降解、加工和扩增竞争等因素都会影响真实食品样本中组织质量与回收DNA之间的关系。
研究局限性包括：商业样本的品种、地理来源和生物学独立性信息不完整；鹅、鹌鹑和鸽以蛋源DNA而非肉源DNA代表；排除性评估仅限于体系内12个靶标；分析灵敏度未对每个靶标正式建立；大鼠-鸽混合物使用纯化DNA而非物理组织混合物；未评估真实食品基质、加工肉制品、热处理样本、高度降解DNA、多组分混合物和含PCR抑制剂样本；重复性评估仅限同一仪器平台上的三次实验室内部检测，未进行实验室间验证。
结论部分翻译如下：本研究开发了一种针对12个预定义靶标的多重PCR-毛细管电泳检测方法：鸭、马、猪、大鼠、鹅、鸡、牛、羊、兔、鹌鹑、鸽和人。在所采用的实验室条件下，该检测方法同时产生具有可区分片段大小的靶标扩增子，12个所测物种间未观察到交叉扩增。在单一实验室内进行的三次检测提供了初步的重复性证据。在纯化的大鼠-鸽DNA混合物中，0.1%是大鼠DNA被稳定检出的最低测试比例。该值不应被解释为正式确定的检测限或等同于物理肉混合物中同等性能的证据。由于未评估近缘非靶标物种、真实混合肉样本、加工食品、降解DNA和复杂食品基质，本研究结果并未确立该检测方法适用于常规食品检测。需要使用更广泛的靶标和非靶标物种、代表性食品基质、更多重复以及实验室间研究进行进一步验证，以确定其分析性能和实际适用性。
