Piennolo番茄叶（Solanum lycopersicum L.）作为芦丁可持续来源的资源化利用：提取工艺优化、抗糖化活性及离体皮肤分布研究

《Food Chemistry: X》：Sustainable valorization of Piennolo tomato leaves ( Solanum lycopersicum L.) as a source of rutin: extraction optimization, antiglycation activity, and ex vivo skin distribution

　　

晚期糖基化终末产物（AGEs）是一类通过还原糖与蛋白质、脂质和核酸等生物分子之间的非酶促糖化反应生成的不可逆化合物异质群体。AGEs的形成主要通过美拉德反应发生，该反应涉及还原糖的羰基与游离氨基缩合，形成不稳定的希夫碱，随后迅速重排为更稳定的阿马多里产物，并可进一步发生氧化、脱水和裂解反应，生成高活性的二羰基化合物，包括甲基乙二醛（MGO）、乙二醛（GO）和3-脱氧葡萄糖醛酮（3-DG），从而促进AGEs的形成。AGEs因其高度化学稳定性和抗酶降解能力而在组织中逐渐积累，其生物学效应通过与细胞外基质蛋白的直接交联以及与特异性细胞表面受体（尤其是晚期糖基化终末产物受体RAGE）相互作用介导。AGE-RAGE轴的激活会触发细胞内信号通路，促进氧化应激、炎症和纤维化，最终导致细胞和组织功能障碍。因此，AGEs的积累与多种年龄相关和代谢性疾病的发生发展密切相关。在皮肤层面，AGEs可损害角质形成细胞的增殖和分化，破坏组织屏障；在真皮层，糖化诱导的胶原蛋白和弹性蛋白交联降低组织弹性和机械韧性，促进皱纹形成。在此背景下，能够抑制AGEs形成或中和活性羰基化合物的天然化合物引起了广泛关注。多酚类物质因其抗氧化、抗炎和抗糖化特性而极具前景。黄酮醇，特别是槲皮素和芦丁（槲皮素-3-O-芸香糖苷），表现出显著的抗糖化活性。与此同时，农业工业副产物的资源化利用作为高价值植物化学物质的可持续来源日益受到重视。番茄（Solanum lycopersicum L.）是全球种植最广泛的作物之一，其叶片作为农业残余生物量，可能是芦丁等生物活性化合物的宝贵来源。维苏威Piennolo樱桃番茄是一种古老的意大利南部品种，享有欧盟原产地保护命名（PDO）。尽管已有研究表明其他番茄品种的叶片富含芦丁，但针对Piennolo番茄叶片的抗糖化潜力及其主要黄酮成分的皮肤分布尚未见报道。因此，本研究旨在开发一种食品级溶剂提取工艺，采用响应面法（RSM）从维苏威Piennolo番茄叶中回收芦丁，并对优化后的Piennolo番茄叶（OPTL）提取物进行HPLC-DAD和HPLC-HESI-MS/MS表征，评估其体外自由基清除和抗糖化活性，并通过离体Franz扩散模型研究芦丁的皮肤分布，以评估OPTL提取物在针对糖化相关皮肤改变和皮肤衰老的局部应用中的潜力。

研究背景与目的

晚期糖基化终末产物（AGEs）是通过还原糖与蛋白质、脂质、核酸等生物分子之间的非酶促糖化反应生成的一类不可逆化合物。AGEs的形成始于美拉德反应，经希夫碱、阿马多里产物等中间阶段，最终生成高活性的二羰基化合物如甲基乙二醛（MGO）、乙二醛（GO）和3-脱氧葡萄糖醛酮（3-DG），进一步促进AGEs积累。AGEs因高度稳定、不易被酶降解而在组织中累积，通过直接交联细胞外基质蛋白和激活AGE-RAGE轴引发氧化应激、炎症和纤维化，与心血管疾病、糖尿病并发症、神经退行性病变及皮肤老化密切相关。在皮肤中，AGEs损害角质形成细胞功能，削弱皮肤屏障，并促使胶原和弹性蛋白交联，导致弹性下降和皱纹形成。

天然化合物，尤其是多酚类物质，因其抗氧化、抗炎和抗糖化作用而成为抑制AGEs形成的候选策略。芦丁（槲皮素-3-O-芸香糖苷）作为一种代表性黄酮醇，已被证实具有较强的抗糖化活性。然而，尽管番茄（Solanum lycopersicum L.）叶片含有丰富的芦丁，但关于Piennolo番茄叶片的抗糖化潜力及其芦丁的皮肤分布研究尚属空白。此外，缺乏针对该品种叶片芦丁提取的食品级溶剂优化方案。为此，研究人员开展了本研究，旨在开发基于响应面法（RSM）的食品级芦丁提取工艺，对优化提取物进行化学成分鉴定和活性评价，并利用离体Franz扩散模型考察芦丁在皮肤各层的分布情况，为其在抗糖化护肤领域的应用提供依据。

主要技术方法

研究人员采用了以下关键技术方法：

1. 1.
   响应面法（RSM）优化提取工艺：以乙醇浓度（0–40%，v/v）、提取时间（10–80 min）和提取温度（25–45 °C）为因素，以芦丁得率为响应值，共设置36组实验条件，最终确定最优提取条件为35 °C下特定乙醇浓度和时间的组合。
2. 2.
   多酚定性与定量分析：采用高效液相色谱-二极管阵列检测-加热电喷雾电离-串联质谱（HPLC-DAD-HESI-MS/MS）进行定性分析，并使用高效液相色谱-二极管阵列检测器（HPLC-DAD）进行定量分析，对优化后Piennolo番茄叶（OPTL）提取物中的24种多酚进行了鉴定和含量测定。
3. 3.
   体外活性评价：通过DPPH和ABTS自由基清除实验评估抗氧化活性，通过牛血清白蛋白（BSA）-果糖/葡萄糖模型评估抗糖化活性，计算半数抑制浓度（IC₅₀）。
4. 4.
   离体Franz扩散实验：采用猪耳皮肤构建Franz扩散池，将OPTL提取物（芦丁浓度2.8 μg/mL）施加于皮肤表面，分别于1、4、8小时收集受体液、表皮和真皮层，利用高效液相色谱-三重四极杆串联质谱（HPLC-qQq-MS/MS）定量分析芦丁在各层的分布。
5. 5.
   方法学验证：评估了芦丁在OPTL提取物和猪耳皮肤基质中的回收率（RE）和基质效应（ME），并建立了线性范围、灵敏度和选择性参数。

研究结果

1. 引言

研究人员指出AGEs的形成机制及其在皮肤老化中的作用，强调天然多酚尤其是芦丁的抗糖化潜力，并提出番茄叶片作为芦丁可持续来源的价值。Piennolo番茄作为PDO产品，其叶片尚未被系统研究。

2. 材料与方法

2.1 试剂：列出了所有化学试剂、标准品及其纯度、来源。

2.2 提取工艺与实验设计：Piennolo番茄叶样品来自意大利坎帕尼亚维苏威地区三个农场，采集时间为2025年9月，属于‘Principe Borghese’生态型。采用RSM三因素初步实验，考察乙醇浓度、时间和温度对芦丁得率的影响，共36组条件，每组三次独立重复。最终固定温度为35 °C，聚焦溶剂组成和时间进行优化。

2.3 OPTL提取物的多酚组成：

• •
  2.3.1 定性分析：采用HPLC-DAD-HESI-MS/MS在负离子模式下鉴定出24种多酚。
• •
  2.3.2 定量分析：通过HPLC-DAD对芦丁及其他多酚进行定量，芦丁为主要黄酮成分。
  2.4 皮肤样本：使用8–9月龄雄性猪耳皮肤，厚度约4 mm，经皮水分散失（TEWL）值低于15 g/m²/h以确保完整性。
• •
  2.4.1 Franz扩散实验：9个Franz扩散池处理组（每时间点3个）加3个空白对照，共12个。OPTL提取物施加浓度为250 μg/mL（对应芦丁2.8 μg/mL），受体室为PBS，37 °C恒温，分别在1、4、8小时后分离表皮和真皮，用80%甲醇-1%甲酸超声提取后，经氮气吹干复溶至20 mg/mL，进行HPLC-MS/MS分析。芦丁分布百分比按公式（Rutin_sample/Rutin_applied）×100%计算。
• •
  2.4.2 HPLC-qQq-MS/MS分析：采用MRM模式，定量离子对为609.3→301.0 m/z（碰撞能36 eV），定性离子对为609.3→300.0 m/z（碰撞能40 eV）。
  2.5 回收率和基质效应评估：在OPTL和猪耳皮肤基质中，于低、中、高三个浓度水平评估了芦丁的ME和RE，计算公式分别为ME(%)=[(A_post-spiked?A_non-spiked)/A_solvent?1]×100和RE(%)=(A_pre-spiked/A_post-spiked)×100。
  2.6 分析方法验证：
• •
  2.6.1 线性、灵敏度与选择性：建立了11种多酚标准品的校准曲线，R2≥0.99，相对残差用于评估模型适用性。

3. 结果（待补充）

由于提供的文档截止于方法学验证部分，后续结果、讨论和结论章节未包含在内。根据摘要可知的关键结论包括：

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  通过RSM成功优化了食品级芦丁提取工艺；
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  OPTL提取物体外抗糖化活性IC₅₀ = 3.6 mg/mL；
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  离体Franz扩散实验证实芦丁在皮肤中具有局部滞留特性；
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  LC-HESI-MS/MS鉴定出24种多酚。

讨论与结论

由于文档中未提供完整的讨论和结论部分，此处根据摘要和引言内容进行总结：研究人员认为，Piennolo番茄叶作为一种农业副产物，具有作为芦丁可持续来源的开发潜力。优化后的提取工艺不仅提高了芦丁得率，还保留了多酚的多样性。体外抗糖化实验表明OPTL提取物能有效抑制AGEs形成，离体皮肤分布实验则显示芦丁主要滞留在表皮和真皮层，提示其适合局部应用以对抗糖化引起的皮肤老化和损伤。这些发现为番茄叶资源的化妆品和功能性原料开发提供了科学依据。