臭氧纳米气泡（Ozone Nanobubble）处理对食品接触表面单核细胞增生李斯特菌生物膜的控制效果研究

《Food Control》：Efficacy of ozone nanobubble treatment for controlling Listeria monocytogenes biofilms on food-contact surfaces

　　

专业术语翻译（摘要部分） 臭氧纳米气泡（Ozone Nanobubble, ONB）处理可有效减少常见食品接触表面上的单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）生物膜。较高的臭氧浓度和较长的暴露时间可提升ONB的处理效果。ONB对幼龄和成熟生物膜表现出相近的杀灭效果。动态流动处理可增强ONB的抗菌性能。表面磨损会降低ONB在聚酯（PET）和橡胶表面的处理效果。

论文解读文章

一、研究背景与意义

单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）是食品工业中备受关注的重要食源性病原菌，其能够在食品接触表面和非接触表面形成生物膜，并能在常规食品安全控制措施下持续存在。该菌污染食品加工表面已与多起即食食品（RTE）相关疫情暴发相关联，例如新鲜包装沙拉、哈密瓜、焦糖苹果、熟食肉制品和奶酪产品等。此外，在用于加工核果、柑橘类水果和树坚果的设备表面检出该菌，已导致多起产品召回事件。这些现象暴露出当前清洗和消毒实践存在的不足，凸显了对食品接触表面开发更有效去污策略的迫切需求。

李斯特菌可在多种食品接触表面形成生物膜，包括不锈钢（SS）、用作刷床刷毛的聚酯（PET）材料以及传送带和辊筒所用的橡胶材料。一旦生物膜形成，可显著增强细菌对常用消毒剂的抗性，且消毒剂效果通常随生物膜成熟而下降。例如，使用200 ppm季铵盐化合物（QAC）处理1分钟，对不锈钢表面1日龄生物膜可实现2.6 log₁₀ CFU/cm²的减少，但对14日龄生物膜仅减少0.4 log₁₀ CFU/cm²。类似地，氯、二氧化氯和过氧乙酸对PET表面7日龄生物膜的效果明显低于对2日龄生物膜。这些发现强调了需要替代性消毒策略来克服老化生物膜增强的抗性并降低交叉污染风险。

臭氧是一种强效氧化剂，对多种食源性病原菌和腐败菌具有强抗菌活性。2001年，美国食品药品监督管理局（FDA）发布最终规则（21 CFR § 173.368），批准臭氧在气相和水相中作为食品加工和储存的次级直接抗菌食品添加剂。由于臭氧迅速分解为氧气，在处理表面或产品上不留化学残留或毒性副产物，其无残留特性使其成为传统化学消毒剂的环保替代品。然而，臭氧固有的不稳定性，半衰期仅30-40分钟（取决于温度和pH值），限制了其实际应用。

纳米气泡（NBs）是液体中直径小于1000 nm的稳定充气结构，通常约100 nm大小。农业应用中使用的臭氧纳米气泡直径通常在20至80 nm之间。通过将臭氧的强氧化特性与纳米尺度气泡空化相结合，臭氧纳米气泡（ONB）技术提供了一种无化学品的氧化方法。将臭氧整合到水中的纳米级气泡中可增强其稳定性和持久性，克服了臭氧溶解度低和快速分解的局限性。纳米气泡与化学消毒剂结合时已显示出改善的抗菌性能。

然而，关于ONB对常见食品接触表面上李斯特菌生物膜效果的数据仍然有限，特别是关于不同处理和表面条件下可能影响其效果的因素。因此，本研究旨在评估ONB对选定食品接触表面（包括不锈钢、聚酯和橡胶）上李斯特菌生物膜的效果，并系统评估影响ONB效果的因素，包括臭氧浓度、处理时间、处理体积、生物膜龄、表面材料和磨损以及应用方式（静态浸没与动态流动）。

二、主要技术方法

研究人员使用了六株单核细胞增生李斯特菌混合菌株（包括血清型1/2a、1/2b和4b的分离株）以及三株英诺克李斯特菌（L. innocua）混合菌株（作为非致病性替代菌）。在不锈钢（AISI 316，4号表面）、聚酯（PET）和硅橡胶表面制备1.5 cm × 0.75 cm的试片。部分试片用80目砂纸手动磨损5分钟以模拟表面老化。生物膜在25°C静态培养2天或7天形成。ONB溶液（2 ppm和4 ppm）使用En Solución臭氧纳米气泡发生器即时生成，以溶解臭氧监测仪确认臭氧浓度。处理方式包括静态浸没（24 mL）和不同体积（0.5、1.0、2.0 L）以及动态流动（1、3、6 L/min）处理。处理后使用Dey-Engley中和肉汤终止抗菌作用，通过涡旋振荡和活菌计数评估生物膜减少量。

三、研究结果

1. ONB稳定性及其对李斯特菌生物膜的效果

4 ppm ONB溶液的稳定性测定显示，臭氧水平在80分钟后从4 ppm逐渐降至0.3 ppm，半衰期约20分钟。对2日龄生物膜的灭活实验表明，ONB效果随浓度和处理时间增加而提高。2 ppm ONB处理1分钟在不锈钢、PET和橡胶表面分别引起1.11、0.90和0.80 log₁₀ CFU/试片的减少；延长至10分钟显著增强效果，分别达到1.33、1.22和1.56 log₁₀ CFU/试片。将浓度从2 ppm提高至4 ppm在所有表面和处理时长上均显著改善抗菌效果（橡胶表面10分钟处理除外）。4 ppm ONB处理1分钟和10分钟在不锈钢、PET和橡胶表面分别实现1.37和2.12、1.24和1.69、1.15和1.74 log₁₀ CFU/试片的减少。

对7日龄生物膜，提高ONB浓度在所有表面上均显著增强生物膜灭活效果。将处理时间从1分钟延长至10分钟在不锈钢和PET表面显著提高效果（不论浓度），但在橡胶表面处理时长对效果无显著影响。值得注意的是，生物膜龄对1分钟ONB处理效果无显著影响（除PET表面2 ppm处理外），表明ONB对幼龄和成熟生物膜效果相近。不含臭氧的纳米气泡处理在所有条件下仅产生小于0.4 log₁₀ CFU/试片的减少，抗菌效果极小。

2. 处理体积和流速对ONB效果的影响

在不锈钢表面7日龄生物膜上，2 ppm ONB处理1分钟时，浸没体积从24 mL增至2.0 L仅产生微小且不显著的减少增加。4 ppm ONB时，体积从24 mL增至0.5 L显著改善生物膜灭活，实现1.65 log₁₀ CFU/试片的减少，但进一步增至2 L未产生额外显著效果。

在动态流动条件下，4 ppm ONB以1 L/min流速处理1分钟实现3.29 log₁₀ CFU/试片的减少。流速从1增至6 L/min对ONB效果无显著影响。仅含氧纳米气泡处理也产生1.64-1.98 log₁₀ CFU/试片的可测量减少，但低于ONB的效果。

3. 表面缺陷对ONB效果的影响

总体而言，PET和橡胶比不锈钢支持更多的生物膜积累，尤其在磨损条件下。磨损PET（7.28 vs 6.94 log₁₀ CFU/试片）和橡胶（7.47 vs 7.17 log₁₀ CFU/试片）上的初始李斯特菌生物膜水平显著高于新表面，而不锈钢新旧表面间无显著差异（6.75 vs 6.69 log₁₀ CFU/试片）。

4 ppm ONB处理显示出表面依赖性的效果差异。在不锈钢上，磨损表面的ONB效果略高于新表面（1分钟：1.40 vs 1.29；10分钟：1.70 vs 1.45 log₁₀ CFU/试片）。相反，磨损PET和橡胶表面的减少量显著低于新表面。PET上1分钟处理在新旧表面分别减少1.26和0.44 log₁₀ CFU/试片，10分钟处理分别减少1.63和0.56 log₁₀ CFU/试片。磨损橡胶表面在1分钟和10分钟处理分别仅减少0.40和0.50 log₁₀ CFU/试片，而新橡胶表面分别为1.09和1.32 log₁₀ CFU/试片。

四、讨论与结论

讨论部分总结： 研究人员指出，ONB提供的抗菌效果与传统水相臭氧系统相当。浓度依赖性和时间依赖性的效果增强与先前臭氧水研究一致。处理时长对橡胶表面成熟生物膜影响有限，可能归因于表面相关特性（如粗糙度或疏水性增加）限制氧化剂渗透。动态流动处理的效果优于静态浸没，可能归因于持续的臭氧递送以及纳米气泡流动的物理效应（包括剪切相关的生物膜破坏）。生物膜龄对ONB效果影响有限，这可能与纳米气泡的高表面积和增强臭氧在生物膜基质内分散的潜力有关，但具体机制未直接评估。表面材料影响ONB效果，磨损PET和橡胶表面效果降低，这与先前关于表面粗糙度损害消毒效果的报道一致；有趣的是磨损不锈钢表面效果反而略高，但机制尚不明确。

结论部分翻译： 本研究评估了ONB作为一种无残留处理方式控制常见食品接触表面（包括不锈钢、聚酯和橡胶）上李斯特菌生物膜的效果。ONB效果随臭氧浓度和处理时间增加而提高，4 ppm ONB比2 ppm处理提供更大的生物膜灭活效果。在测试条件下，生物膜龄对短时暴露的ONB效果影响有限。表面材料和表面磨损显著影响ONB效果。ONB效果因表面材料而异，而磨损的PET和橡胶表面相比相应新表面显示出降低的敏感性。动态处理比静态处理实现更大的生物膜减少；然而，由于两种处理模式分别使用英诺克李斯特菌和李斯特菌进行评估，直接比较应谨慎解读。需要进一步研究以验证ONB在商业食品加工条件下的效果，并评估其与互补干预措施结合作为栅栏式消毒策略一部分的应用。