Tcf4缺陷上调mGlu7表达：Pitt Hopkins综合征模型中的新发现

《Gene Expression Patterns》：mGlu 7 expression is upregulated by Tcf4 deficiency in a model of Pitt Hopkins syndrome

　　

在Pitt Hopkins综合征模型中，mGlu7表达因Tcf4缺陷而上调。研究人员发现Tcf4缺陷增加小鼠脑内mGlu7表达，并观察到mGlu7剪接变体的区域特异性调控。在Tcf4^+/?小鼠大脑皮层中，mGlu7B优先增加。这些发现与Rett综合征中mGlu7表达减少形成对比。

Pitt Hopkins综合征（PTHS）是由转录因子4（Transcription Factor 4, TCF4）基因功能缺失或显性负性突变引起的罕见神经发育障碍，患者常表现出智力障碍、运动异常和呼吸问题等。由于PTHS与甲基化CpG结合蛋白2（MeCP2）突变导致的Rett综合征（RTT）在临床上高度重叠，PTHS患者常被误诊为RTT。此前研究发现，PTHS与RTT小鼠模型在表型与病理特征上存在许多相似之处，如恐惧记忆受损、焦虑减弱、小头畸形以及动态染色质调控的丧失。TCF4属于碱性螺旋-环-螺旋转录因子家族，可结合基因组中编码E-box的调控区域。2018年，Xia等人在SH-SY5Y细胞中绘制了人类基因组TCF4结合位点图谱，将编码代谢型谷氨酸受体7（mGlu7）的GRM7基因列为TCF4的潜在靶点。mGlu7属于第III组代谢型谷氨酸受体，主要位于突触前活性区，调节谷氨酸和GABA的释放；GRM7基因的原发性突变可导致严重的神经发育表型。鉴于RTT与PTHS的临床重叠以及GRM7启动子区域存在TCF4结合位点，研究人员最初假设Tcf4单倍剂量不足会导致mGlu7表达降低。为验证这一假设，研究人员利用Tcf4^+/?小鼠模型开展了系统表达谱分析，然而结果却与预期相反：mGlu7在Tcf4缺失背景下表达升高，且剪接变体呈现区域特异性调控。

研究人员使用从Jackson Laboratory获得的Tcf4^+/?小鼠（B6;129-Tcf4tm1Zhu/J），将其与C57BL/6J小鼠回交，并纳入雌雄动物及同窝野生型对照，取20–25周龄小鼠的皮层、海马、纹状体和小脑。主要关键技术方法包括：定量实时PCR（qRT-PCR）检测Grm7 mRNA水平，使用TaqMan探针及SYBR Green染料；RNAscope原位杂交技术对Grm7 mRNA进行细胞水平定位与半定量分析；Western blot采用可同时识别mGlu7A和mGlu7B两种变体的抗体以及选择性识别mGlu7A的抗体，比较剪接变体在不同脑区的蛋白表达；免疫荧光用识别两种变体的抗体观察皮层及海马区的蛋白分布，并以Grm7敲除小鼠作为阴性对照。上述方法可相互印证mRNA和蛋白表达变化，并区分不同剪接变体的贡献。

研究结果分为四个方面。第一，皮层中Grm7 mRNA表达升高。通过qRT-PCR检测四个脑区，结果显示与Tcf4^+/+小鼠相比，Tcf4^+/?小鼠皮层中Grm7 mRNA水平显著增加，而海马、纹状体和小脑中的mRNA水平无显著差异。第二，RNAscope进一步证实皮层和海马特定亚区的mRNA升高。在皮层区，Tcf4^+/?小鼠Grm7 mRNA信号强度显著高于对照；在海马中，CA3和齿状回（DG）区域mRNA显著增加，而CA1区域无明显变化，提示mGlu7 mRNA在海马内呈亚区特异性调控。第三，mGlu7蛋白剪接变体呈区域特异性变化。Western blot使用识别mGlu7A和mGlu7B的抗体检测时，发现Tcf4^+/?小鼠皮层和小脑中的总mGlu7蛋白显著升高，而海马与纹状体无显著变化；使用mGlu7A特异性抗体时，仅在小脑检测到显著增加，皮层、海马和纹状体均无显著性差异。这些结果表明，皮层中优先增加的可能是mGlu7B，而小脑中增加的则是mGlu7A，即Tcf4单倍剂量不足对mGlu7剪接变体具有区域特异的调控作用。第四，免疫荧光验证了蛋白质水平的增加。利用识别mGlu7A和mGlu7B的抗体进行免疫组化染色，发现皮层中mGlu7蛋白信号显著升高；在海马亚区中，CA1区蛋白表达显著增加，而CA3和DG区域无显著变化。这一结果与RNAscope检测到的mRNA升高区域并不完全重合，研究人员认为这可能反映了mRNA在胞体表达，而mGlu7蛋白则定位到投射至CA1区的轴突末端。

讨论部分指出，Tcf4杂合性所致的mGlu7表达上调与RTT模型中的mGlu7表达降低截然相反。这种差异可能与两种模型中突触可塑性异常方向的不同有关：Mecp2^+/?小鼠海马长时程增强（LTP）降低，而Tcf4^+/?小鼠LTP增强，mGlu7活性许可LTP诱导，因此mGlu7表达改变可能参与这些相反的表型。此外，尽管mGlu7A与mGlu7B在体内功能区别尚不明确，本研究通过变体特异性抗体揭示了两种剪接形式在Tcf4杂合背景下存在差异调控，并提示可能有反馈机制维持总mGlu7表达水平。临床数据库中报道了数十种GRM7重复变异，这些变异同样造成神经发育异常，表明GRM7剂量敏感。研究总结认为，TCF4可能作为神经元中特定蛋白质稳态的高级调控因子，通过转录及转录后机制影响mGlu7表达；GRM7基因需要受到严格控制以避免神经发育表型。本研究凸显了mGlu7在PTHS病理机制中的潜在角色，并为针对mGlu7变体选择性药物的开发提供了依据。