单条gRNA CRISPR/eCas9介导的结直肠癌细胞中cIAP1与cIAP2同时靶向：RNA-seq揭示不同的转录组与凋亡反应

《Gene》：Single-gRNA CRISPR/eCas9-mediated simultaneous targeting of cIAP1 and cIAP2 in colorectal cancer cells: RNA-seq reveals distinct transcriptomic and apoptotic responses

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  单gRNA CRISPR/eCas9在HCT-116细胞中同时靶向cIAP1和cIAP2。
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  双重cIAP1/cIAP2靶向引起的凋亡强于单个敲除。
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  cIAP1/cIAP2同时缺失显著降低增殖和克隆存活。
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  RNA-seq揭示双重cIAP1/cIAP2耗竭的特异性转录组反应。
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  MIR663AHG在cIAP1/cIAP2同时靶向后强烈上调。

引言

凋亡抑制蛋白（IAP）家族是一组进化上保守的蛋白质，在调节程序性细胞死亡即凋亡中起着至关重要的作用。该家族的特征是具有一个或多个杆状病毒IAP重复序列（BIR）结构域，这是其抗凋亡活性所必需的（Oberoi-Khanuja等人，2012年；O'Riordan等人，2008年）。IAP家族成员通过抑制caspase的活性来发挥作用，caspase是一种切割特定细胞蛋白的蛋白酶，最终导致细胞死亡。IAP与caspase结合，阻止其激活并阻断凋亡信号通路（Kumar等人，2020年；Victoria-Acosta等人，2016年）。IAP家族在人类中包含八个成员：cIAP1、cIAP2、XIAP、NAIP、survivin、livin、Apollon和Bruce。虽然所有IAP都共享BIR结构域，但它们在其它结构域和功能上有所不同。例如，XIAP被认为是最强的caspase抑制剂，而survivin则调节有丝分裂和凋亡（Hrdinka和Yabal，2019年；Fulda，2014年；Cossu等人，2012年）。IAP的异常表达与多种疾病有关，包括癌症、自身免疫性疾病和神经退行性疾病。因此，IAP家族已成为开发治疗这些疾病药物的有吸引力的靶点。为此，目前已开发了多种IAP小分子抑制剂，并正在临床研究中（Marinowic等人，2020年；Li等人，2022年；Pluta等人，2015年；Wang等人，2019年）。

细胞凋亡抑制蛋白1和2（cIAP1和cIAP2，分别由BIRC2和BIRC3编码）含有多个杆状病毒IAP重复序列（BIR）基序和一个催化性RING指结构域，赋予其E3泛素连接酶活性（Wang等人，2021年；Bertrand等人，2011年；Choi等人，2009年；Zhou等人，2013年；Zhang等人，2018年）。cIAP1和cIAP2还参与调节凋亡的内源性通路。在该通路中，cIAP1和cIAP2与促凋亡蛋白SMAC结合并将其泛素化，SMAC在凋亡过程中从线粒体释放。cIAP1和cIAP2对SMAC的泛素化使其被靶向降解，从而防止其抑制cIAP1和cIAP2的活性。进而，cIAP1和cIAP2通过阻止caspase-9及下游效应caspase的激活来抑制内源性通路（Moulin等人，2012年；Boyd-Tressler等人，2017年；Roscioli等人，2013年；Gordon等人，2007年；Knoll和Ehrenschwender，2021年；Xu等人，2020年）。另一方面，外源性凋亡通路由细胞外死亡受体（如TRAIL和TNF受体）与其配体结合触发。这导致接头蛋白（如FADD和TRAF2）的募集，进而募集并激活caspase-8以启动凋亡通路（Wang等人，2008年；Lee等人，2015年；Nagata等人，2011年；Bourguignon等人，2012年；Nakamura等人，2011年）。cIAP1和cIAP2通过结合并泛素化该通路的组分，在调节外源性凋亡通路中发挥关键作用。具体而言，cIAP1和cIAP2可以泛素化caspase-8并将其靶向降解，从而阻止其激活并抑制凋亡。此外，cIAP1和cIAP2还可靶向其它外源性通路组分，如RIP1，进行泛素化和降解，进一步抑制凋亡（Nakamura等人，2011年；Yang等人，2016年；Su等人，2019年；Jiang等人，2017年）。此外，研究表明，cIAP1和cIAP2在多种类型的癌症中表达水平高于健康正常细胞，并有助于过度增殖、凋亡抵抗以及对肿瘤细胞治疗的耐受性（Lee等人，2025年；Dagenais等人，2016年；Darding等人，2011年；Meyer，2022年）。此外，在一项使用CRISPR/Cas9系统对结直肠癌细胞系HT29的研究中，BIRC2和BIRC3基因被分别敲除。然而，在此情况下，研究表明HT29细胞能够轻易耐受单个cIAP1或cIAP2家族成员的缺失（Chirieleison等人，2018年）。总体而言，cIAP1和cIAP2通过靶向关键组分进行泛素化和降解，在调节外源性和内源性凋亡通路中发挥着关键作用。

结直肠癌是一个重大健康问题，某些人口群体中相关死亡率有所上升。这种情况凸显了对高风险人群加强筛查和靶向干预的迫切需求（Rahmat和He，2024年；The Lancet Gastroenterology & Hepatology，2020年；Muller等人，2021年）。早期筛查至关重要，因为它能在疾病早期阶段发现病变，从而显著改善患者预后。此外，开发新的治疗策略也必不可少，因为早期诊断与创新疗法的结合为改善结直肠癌患者的预后提供了最佳机会（Biller和Schrag，2021年；Shin等人，2023年；Modest等人，2019年）。

CRISPR/Cas9是一种强大的基因编辑工具，可以在细胞中敲低甚至敲除特定基因。CRISPR/Cas9系统利用向导RNA（gRNA）引导Cas9核酸内切酶定位到基因组中的特定DNA序列。一旦Cas9蛋白结合到DNA上，即可在该位点诱导双链断裂（DSB）。这种DSB会触发细胞DNA修复反应，可用于敲低或敲除靶基因（Bat?r等人，2019年）。另一方面，针对Cas酶用于不同目的的改进工作仍在进行中。其中一项改进是开发了eCas9（增强特异性Cas9）酶，这是一种经过工程改造的Cas9变异体，旨在提高其特异性。使用eCas9有助于减轻Cas9相关的潜在脱靶效应，从而提高基于CRISPR的基因编辑的精确性和安全性（Kulcsár等人，2020年）。通过这种方式，BIRC2和BIRC3基因可通过CRISPR/eCas9系统进行敲除，从而降低其细胞表达。在癌细胞中敲除BIRC2和BIRC3基因会产生一些效应，包括增加凋亡、降低增殖以及增强对化疗的敏感性，如前所述。因此，利用CRISPR/eCas9敲除BIRC2和BIRC3可以成为研究这些基因在癌症生物学中作用以及开发新策略的有价值工具。

在本研究中，我们基于结直肠癌细胞能够耐受cIAP1或cIAP2单独缺失的既往证据，开发了一种单gRNA引导的CRISPR/eCas9策略，以同时靶向BIRC2和BIRC3。为鉴定适合同时靶向的序列，首先使用MEGA分析了BIRC2和BIRC3之间的核苷酸序列相似性。该分析鉴定了这两个基因共有的相同核苷酸序列。随后在BIRC2和BIRC3第2外显子的同源区域内设计了候选gRNA，包括一条能够同时靶向两个基因的单gRNA。同时，还分别设计了单独靶向BIRC2或BIRC3的独立gRNA。因此，在人结直肠癌细胞系HCT-116中，从细胞和转录组水平研究了单独和同时靶向BIRC2及BIRC3的效应，以确定cIAP1和cIAP2联合破坏如何影响癌细胞存活，并评估其作为治疗靶点的潜力。

各章节摘要

细胞系和培养

HCT-116细胞（ATCC；RRID: CVCL_0291），一种人结直肠癌细胞系，培养于含有10%胎牛血清（Gibco，美国）、1X青霉素/链霉素（Gibco，美国）和1X L-谷氨酰胺（Gibco，美国）的高糖DMEM培养基（Gibco，美国）中。为保持实验的完整性，所有细胞培养物在使用前均使用EZ-PCR支原体检测试剂盒（20-700-20，Sartorius）进行支原体污染筛查，并确认为阴性。培养细胞随后

针对BIRC2和BIRC3的gRNA设计及计算机验证

在研究的初始阶段，候选gRNA基于高特异性标准进行设计和选择。所选gRNA与其预测的脱靶候选位点至少有三个错配，并优先选择预测脱靶位点位于内含子或基因间区的向导RNA，以最大程度地减少功能干扰的可能性（图1A–C）。所选gRNA靶向BIRC2（11号染色体：102350040）和BIRC3（11号染色体：102324645）的第2外显子。

讨论

结直肠癌是一种恶性疾病，其死亡率在全球仅次于肺癌位居第二，且在年轻人群中的发病率正在上升（Muller等人，2021年；Fabregas等人，2022年）。另一方面，癌症的关键特征之一是其逃避凋亡的能力，凋亡是程序性细胞死亡的过程（Adams和Cory，2007年）。在凋亡信号调节因子中，细胞凋亡抑制蛋白cIAP1和cIAP2对

结论

本研究表明，使用单gRNA CRISPR/eCas9策略同时耗竭cIAP1和cIAP2对HCT-116细胞存活和凋亡的影响，比单独敲除任一蛋白质更为显著。虽然cIAP1或cIAP2的单独敲除允许持续的克隆生长，但在同时靶向后未能获得任何增殖编辑克隆，这表明这些蛋白质具有部分代偿性的促存活功能。此外，

CRediT作者贡献声明

Muhammet Burak Bat?r：写作–审阅与编辑，写作–原稿撰写，可视化，验证，监督，软件，资源，项目管理，方法学，调查研究，资金获取，正式分析，数据管理，概念构思。

资金

本研究由马尼萨恰拉尔·巴亚尔大学科学调查部门提供资金支持，项目编号为2023-090。

伦理声明

作者无内容可报告。

利益冲突声明

作者声明，他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系，这些利益或关系可能影响本文所报告的工作。