基于循环肿瘤DNA的肿瘤微环境分层预测结直肠癌预后与靶向治疗反应

《Genes & Diseases》：Circulating tumor DNA-based stratification of the tumor microenvironment for predicting prognosis and targeted therapy response in colorectal cancer

　　

循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）是预测结直肠癌（colorectal cancer, CRC）预后和治疗反应的有前景的生物标志物。然而，肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）对CRC进展和治疗至关重要，但在ctDNA分析中尚未被探索。研究人员收集了2017年至2023年间192例患者的临床病理和ctDNA数据，并在多个时间点对ctDNA样本进行了基于panel的高通量深度下一代测序（next-generation sequencing, NGS）。研究结果显示，免疫细胞浸润增加和三级淋巴结构（tertiary lymphoid structures, TLSs）与良好预后呈正相关。患者被分为TME-High和TME-Low两组。TME-High组表现出数量更多、面积更大的肿瘤邻近TLSs，且具有不同成熟度，而TME-Low组主要以早期TLSs为主。多重免疫荧光分析显示，TME-High组中CD8⁺ T细胞和Foxp3⁺ Treg细胞的密度显著更高。将肿瘤微环境评分与其他临床病理因素整合的列线图能有效预测CRC患者1至5年的结局。此外，研究人员开发了基于ctDNA的机器学习算法，纳入关键基因组标志物（如TP53和DNMT3A），以有效识别肿瘤对免疫浸润敏感的患者。验证队列进一步证实了这些患者从靶向治疗中的获益。总体而言，该研究强调了基于ctDNA的免疫分型作为一种有前景的非侵入性工具用于CRC患者监测，为未来临床实践中更个性化的治疗策略奠定了基础。

结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是全球癌症相关死亡的主要原因之一，近年发病率在50岁以下人群中呈上升趋势。尽管靶向治疗已改变治疗范式，但基于肿瘤细胞特征的简单分型不足以预测治疗反应。肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）在肿瘤发生、增殖和转移中发挥关键作用，其中免疫细胞浸润程度和三级淋巴结构（tertiary lymphoid structures, TLSs）被认为是影响预后和治疗反应的重要因素。然而，传统组织活检难以全面反映TME的时空异质性。循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）作为非侵入性液体活检标志物，可反映肿瘤整体状态，但既往研究较少将ctDNA与TME分层相结合。因此，研究人员旨在利用ctDNA数据构建TME分层策略，以预测CRC患者预后和靶向治疗反应。

研究人员收集了2017—2023年间上海交通大学医学院附属瑞金医院192例CRC患者的临床病理和ctDNA数据，通过免疫组化和多重免疫荧光分析TME特征，开发了基于随机森林的ctDNA分型模型，并在外部验证队列中评估其预测靶向治疗获益的能力。研究发表于《Genes》。

主要技术方法：研究纳入192例CRC患者（瑞金医院队列），收集术前及随访期间共313次ctDNA检测。主要技术方法包括：基于769个癌症相关基因panel的靶向深度测序（约2 Mb），用于检测体细胞突变、计算血液肿瘤突变负荷（blood-based tumor mutational burden, bTMB）、ctDNA含量分数（ctDNA content fraction, CCF）、拷贝数不稳定性（copy number instability, CNI）评分和突变等位基因肿瘤异质性（mutant allele tumor heterogeneity, MATH）评分；利用H&E染色和多重免疫荧光（multiplex immunofluorescence, mIF）评估TLS数量、面积、成熟度及免疫细胞（CD3、CD8、Foxp3、CD20、CD21、CD23、CD68、CXCL13等）密度；通过随机森林分类器整合TLS和免疫浸润特征，将患者分为TME-High和TME-Low；采用Cox回归构建列线图；使用SHAP值解释模型；并在两个外部独立队列（HER2扩增转移性结直肠癌（metastatic colorectal cancer, mCRC）患者29例、RAS野生型难治性mCRC患者23例）中验证模型预测靶向治疗反应的能力。

研究结果：

（一）基于TME分型的发现队列概述：研究人员利用随机森林模型将192例患者分为TME-High（n=93）和TME-Low（n=99）。H&E染色评估TLS数量、位置和成熟度，发现初级滤泡样TLS（primary follicle-like TLS, PFL-TLS）和次级滤泡样TLS（secondary follicle-like TLS, SFL-TLS）总数与良好预后正相关；PFL-TLS+SFL-TLS≥3的患者生存期显著延长（P=0.021）。

（二）不同TME亚区中TLS的特征：连续切片和多重免疫荧光显示，TME-High组TLS总数和总面积显著更大，成熟TLS（PFL-TLS和SFL-TLS）比例更高；而远肿瘤区域TLS无显著差异。排除新辅助治疗病例后结果仍一致。

（三）亚区间免疫组成的异质性：多重免疫荧光显示TME-High组肿瘤内TLS中CD8⁺ T细胞和Foxp3⁺ Treg细胞密度显著升高，且Treg细胞在成熟TLS中IL-10⁺表达更高，而TME-Low组CTLA-4表达相对较高；肿瘤周围区域无差异。

（四）TME组间的预后分析：TME-Low组中右半结肠癌预后较差；TME-High组中淋巴血管浸润、神经周围浸润和晚期肿瘤分期与更差预后相关。

（五）TME状态预测预后：构建的列线图整合TME状态和临床变量，预测1-5年总生存期（overall survival, OS）的AUC为0.822-0.850，C-index为0.761（内部验证后0.701）。

（六）CRC中基于ctDNA的基因组特征：ctDNA分析显示TP53和DNMT3A突变频率在两组间有显著差异；TME-Low组CCF和CNI显著更高，bTMB和MATH无差异。

（七）基于TME状态的ctDNA突变随机森林分类器：使用前20个突变基因构建随机森林模型，5折交叉验证，在验证队列中平均AUROC为0.796，精确率0.812，召回率0.775，F1分数0.793。SHAP值显示TP53和DNMT3A对分类贡献显著。

（八）TME状态指导临床可操作分层：64%的TP53突变和65%的DNMT3A突变病例为TME-Low；3、5、10基因panel均可有效分层TME状态。外部验证队列中，TME-High的HER2扩增mCRC患者接受帕妥珠单抗+曲妥珠单抗治疗反应更好；RAS野生型难治性mCRC患者接受帕尼单抗联合化疗时TME-High组无进展生存期（progression-free survival, PFS）更优（P=0.044）。

讨论部分指出，TME-High组中Foxp3⁺ Treg细胞虽通常被视为免疫抑制，但在TLS丰富的免疫活跃肿瘤中可能发挥免疫调节作用，IL-10⁺ Treg与良好预后相关，而CTLA-4高表达见于TME-Low组。TP53、DNMT3A等突变与免疫浸润相关，但应视为关联标志物而非直接驱动因素。研究局限包括缺乏三维空间评估、外部验证队列样本量小（尤其RAS野生型队列n=23）、机器学习过拟合风险以及缺乏前瞻性干预验证。结论：本研究证明TME状态与CRC患者生存结局密切相关；基于ctDNA的免疫分型策略可识别可能从靶向治疗中获益的患者，为非侵入性监测和个体化治疗提供理论基础。研究人员表示，这些发现为CRC患者的个体化治疗提供了理论基础，并可能指导基于该分层策略的未来前瞻性研究。