《Genes & Diseases》：The FOXO3A/β-Catenin pathway mediates the inhibitory effect of GSS on ferroptosis in lung cancer cells
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代谢重编程（metabolic reprogramming），尤其是氨基酸代谢（amino acid metabolism），在肿瘤进展和治疗抵抗中发挥关键作用；然而，其对肺癌的机制性贡献仍未完全阐明。谷胱甘肽合成酶（GSS）是谷胱甘肽生物合成（glutath
代谢重编程（metabolic reprogramming），尤其是氨基酸代谢（amino acid metabolism），在肿瘤进展和治疗抵抗中发挥关键作用；然而，其对肺癌的机制性贡献仍未完全阐明。谷胱甘肽合成酶（GSS）是谷胱甘肽生物合成（glutathione biosynthesis）中的关键酶，尚未在该背景下被系统研究。研究人员开展了整合转录组（transcriptomic）和单细胞（single-cell）分析，以识别与预后相关的氨基酸代谢相关基因。研究人员在A549和H1299细胞中通过增殖、克隆形成、迁移和侵袭实验评估GSS的功能作用。研究人员利用erastin和ferrostatin-1，并结合活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）、GSH/GSSG、4-羟基壬烯醛（4-HNE）检测和透射电子显微镜（TEM）评估铁死亡（ferroptosis）。机制研究包括共免疫沉淀（Co-IP）、蛋白印迹（Western blotting）、荧光素酶报告基因实验（luciferase reporter assays）和实时定量PCR（qPCR）。研究人员进一步考察了丁硫氨酸亚砜亚胺（BSO）和PRI-724的药理学抑制。GSS被鉴定为肺癌的不良预后因素。GSS敲低显著抑制体外恶性表型和体外肿瘤生长。机制上，GSS缺失增强铁死亡，其特征为脂质过氧化（lipid peroxidation）增加、ROS蓄积和氧化还原稳态（redox homeostasis）破坏。GSS与FOXO3A相互作用并促进β-catenin信号，导致致癌靶点（oncogenic targets）上调，包括MYC和CCND1。此外，联合抑制谷胱甘肽合成和β-catenin信号产生协同抗肿瘤效应。GSS通过FOXO3A/β-catenin轴作为肺癌进展和铁死亡抵抗的关键调控因子。靶向GSS介导的代谢和信号通路可能为肺癌提供有前景的治疗策略。
研究背景：肺癌仍是癌症相关死亡的主要原因，许多患者确诊时已处晚期并迅速产生治疗抵抗。低剂量CT筛查、分子靶向治疗和免疫检查点阻断已改变肺癌管理，但瘤内异质性、谱系可塑性、转移、免疫逃逸和适应性抵抗仍限制持久获益。分子层面，PI3K、JAK、NF-κB、HIF-1α和Wnt/β-catenin等致癌信号网络相互连接，重塑营养利用、氧化还原平衡、生物合成和应激耐受。代谢重编程尤其是氨基酸代谢，在肿瘤进展和治疗抵抗中起关键作用；谷氨酰胺代谢、丝氨酸–甘氨酸一碳通路和胱氨酸/谷胱甘肽通路汇聚于氧化还原缓冲、表观调控、免疫重塑和铁死亡（ferroptosis，铁依赖性脂质过氧化驱动的细胞死亡）控制。谷胱甘肽合成酶（GSS）催化谷胱甘肽生物合成的最终ATP依赖步骤，将γ-谷氨酰半胱氨酸和甘氨酸转化为还原型谷胱甘肽；通过GSH–GPX4轴解毒磷脂氢过氧化物并保护肿瘤细胞免受铁死亡。与SLC7A11、GCLC和GPX4等上游调控因子相比，GSS在肺癌中的肿瘤特异性功能仍不充分。研究人员旨在明确GSS是否仅为代谢酶，还是肺癌进展中的主动信号调控因子，并探索其是否通过FOXO3A/β-catenin轴促进恶性表型和铁死亡抵抗；该研究发表于《Genes》。其意义在于：概念上识别代谢酶作为氧化还原稳态和β-catenin信号调控因子；治疗上提示同时破坏谷胱甘肽合成和β-catenin依赖生存信号可能暴露GSS高肺癌的代谢脆弱性。
关键技术方法：研究人员整合公共肺癌转录组数据（Gene Expression Omnibus，GEO；GSE29016和GSE19188用于外部生存验证）和单细胞RNA测序数据（GSE131907），开展Cox回归、Kaplan–Meier生存分析、CIBERSORT免疫浸润、GO/KEGG富集、拟时序、CytoTRACE和转录因子活性分析；在A549和H1299细胞中构建GSS敲低/过表达模型，采用增殖、克隆形成、Transwell迁移/侵袭、划痕、erastin/ferrostatin-1铁死亡模型，检测ROS、MDA、GSH/GSSG、4-HNE和透射电子显微镜（TEM）线粒体形态；通过共免疫沉淀（Co-IP）、Western blotting、荧光素酶报告基因和qPCR解析FOXO3A/β-catenin轴；并用BSO和PRI-724进行药理抑制。
研究结果：
1. Single-cell transcriptomic profiling reveals cellular heterogeneity in lung cancer（单细胞转录组分析揭示肺癌细胞异质性）：通过单细胞RNA测序对45,757个细胞进行质控、聚类和降维，注释上皮细胞、T细胞、NK细胞、B细胞、巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞、内皮细胞、平滑肌细胞和树突状细胞；正常与肿瘤样本细胞组成不同，肿瘤组织免疫和基质成分增加；配体–受体分析显示上皮细胞与免疫/基质细胞广泛互作，提示上皮细胞可能为信号枢纽。
2. Functional annotation and signaling pattern analysis in the lung cancer microenvironment（肺癌微环境功能注释和信号模式分析）：通过marker评分、RNA velocity、功能富集和outgoing/incoming信号分析，验证细胞注释并显示细胞动态转变；内皮细胞富集迁移/黏附，巨噬细胞富集免疫激活和抗原提呈，平滑肌细胞富集细胞外基质组织，上皮细胞富集伤口愈合和毒性反应；巨噬细胞广泛输出MIF、galectin、VEGF、SPP1、IL1、TGFβ等信号。
3. Amino acid metabolism-related gene signatures reveal metabolic heterogeneity across cell populations（氨基酸代谢相关基因特征揭示细胞群代谢异质性）：通过单细胞表达热图、feature plot、密度可视化和内皮细胞差异表达分析，发现氨基酸代谢基因在不同细胞簇异质分布，GSS、PAH、OAZ1、SLC7A5、GLS2等呈簇特异性富集，内皮细胞中氨基酸代谢基因上调和下调并存。
4. Dynamic Amino Acid Metabolism-Related Programs Define Heterogeneous Endothelial Cell States（动态氨基酸代谢程序定义异质性内皮细胞状态）：通过拟时序、t-SNE、基因–基因互作网络、CellChat、CytoTRACE、表型分布和转录因子regulon分析，显示氨基酸代谢程序随细胞状态动态变化；GSS等表达呈状态特异；GSS-End-C16等内皮亚群分化潜能和表型不同，GSS-End-C16中STAT1、IRF7、IRF8、BCL3 regulon高活性。
5. GSS is associated with unfavorable survival in lung cancer（GSS与肺癌不良生存相关）：通过单因素Cox回归发现高GSS表达与总生存（OS）风险增加（HR=1.3177，95%CI：1.0060–1.7260，P=0.0452）和疾病特异性生存（DSS）不良（HR=1.4677，95%CI：1.0459–2.0595，P=0.0264）相关；GSE29016和GSE19188队列Kaplan–Meier分析验证高GSS组OS更差；CIBERSORT显示免疫细胞群体差异；GO/KEGG富集显示GSS高组细胞周期、DNA复制、p53信号、谷胱甘肽代谢等富集。
6. GSS knockdown suppresses malignant phenotypes of lung cancer cells in vitro（GSS敲低抑制肺癌细胞体外恶性表型）：通过shGSS-1/2在A549和H1299细胞构建稳定敲低并经Western blotting验证；生长曲线、克隆形成、Transwell迁移/侵袭和划痕实验显示GSS沉默降低增殖、克隆能力、迁移和侵袭。
7. GSS knockdown enhances erastin-induced ferroptosis in lung cancer cells（GSS敲低增强erastin诱导的肺癌细胞铁死亡）：通过erastin和ferrostatin-1处理、细胞活力/死亡检测、ROS、MDA、GSH/GSSG、4-HNE Western blotting和TEM，发现GSS敲低增加erastin敏感性，Fer-1逆转细胞死亡，ROS、MDA和4-HNE升高，GSH/GSSG降低，并出现线粒体皱缩、膜密度增加和嵴减少。
8. GSS activates the FOXO3A/β-catenin signaling axis in lung cancer cells（GSS激活肺癌细胞FOXO3A/β-catenin信号轴）：通过Co-IP发现GSS与FOXO3A内源互作；GSS敲低降低总β-catenin、磷酸化β-catenin及c-Myc、Cyclin D1和LGR5；TOP/FOP荧光素酶和qPCR显示β-catenin/TCF转录活性及MYC、CCND1、LGR5降低；GSS过表达激活β-catenin信号，FOXO3A敲低减弱该效应。
9. Combined inhibition of glutathione synthesis and β-catenin signaling exerts synergistic antitumor effects in lung cancer cells（联合抑制谷胱甘肽合成和β-catenin信号在肺癌细胞中产生协同抗肿瘤效应）：通过BSO、PRI-724及联合处理A549细胞，联合治疗最显著抑制增殖、克隆形成和迁移；BSO增加MDA并降低GSH/GSSG，联合组GSH/GSSG最低；PRI-724及联合降低MYC、CCND1和LGR5。
讨论与结论：讨论部分总结GSS为肺癌预后相关氨基酸代谢驱动因子，GSS敲低抑制多种恶性表型；谷胱甘肽作为主要细胞内抗氧化剂和GPX4等谷胱甘肽过氧化物酶辅因子，可解毒脂质氢过氧化物并防止铁死亡膜损伤，GSS作为谷胱甘肽合成终末酶可能是下游代谢瓶颈。GSS缺失使肺癌细胞对erastin诱导的铁死亡敏感，表现为活力下降、死亡增加、ROS蓄积、MDA和4-HNE升高、GSH/GSSG下降及线粒体皱缩；讨论将这些表型归因于谷胱甘肽可用性的“双打击”效应。研究提出GSS–FOXO3A–β-catenin信号轴：Co-IP显示GSS与FOXO3A互作，GSS敲低抑制β-catenin活性并降低MYC、CCND1和LGR5；讨论指出FOXO3A和β-catenin功能具有背景依赖性，β-catenin信号可与铁死亡抵抗相连，GSS可能通过维持谷胱甘肽生物合成和激活FOXO3A依赖的β-catenin信号形成双重保护。讨论还涉及GSS介导的铁死亡抵抗对肿瘤免疫的双刃剑效应、NRF2信号协同、β-catenin对上皮–间质转化/细胞外基质/干性的影响以及FOXO3A可能参与铁死亡调控。局限包括GSS–FOXO3A相互作用的分子基础未明，β-catenin与铁死亡防御靶点的直接关系未系统检查，研究主要使用A549和H1299细胞，免疫微环境未探索。
研究结论翻译：本研究将GSS鉴定为与肺癌进展相关的预后性氨基酸代谢驱动因子。GSS高表达与不良生存相关，而GSS敲低抑制增殖、迁移、侵袭和肿瘤生长。机制上，GSS缺失破坏谷胱甘肽稳态、增强脂质过氧化，并使肺癌细胞对erastin诱导的铁死亡敏感。此外，GSS与FOXO3A相互作用并激活β-catenin信号，从而促进致癌转录程序。联合抑制谷胱甘肽合成和β-catenin信号产生更强抗肿瘤效应，支持GSS作为肺癌中有前景的生物标志物和治疗脆弱点。
