整合多组学分析与实验验证揭示RFTN1通过ANXA5–PKM2轴抑制高甘油三酯血症相关急性胰腺炎中的M1极化

《Genes & Diseases》：Integrated multi-omics analysis and experimental validation reveal RFTN1 suppresses M1 polarization via the ANXA5–PKM2 axis in hypertriglyceridemia-associated acute pancreatitis

　　

高甘油三酯血症相关急性胰腺炎（hypertriglyceridemia-associated acute pancreatitis, HTG-AP）是一种以脂质代谢紊乱和过度炎症为特征的代谢驱动型炎症性胰腺疾病。脂筏作为脂质信号传导的关键平台，其在HTG-AP中将脂质过载与巨噬细胞驱动的炎症相关联的作用尚不清楚。研究人员整合单细胞RNA测序（single-cell RNA-sequencing）和RNA测序（RNA-sequencing）数据，阐明了胰腺损伤中脂筏的组学特征，并进一步凸显了RFTN1在巨噬细胞代谢转换中的潜在作用。随后，在野生型或Rftn1^{flox/flox,lyz2-cre}（Rftn1–/–）小鼠中诱导HTG-AP模型，并通过靶向脂肪酸代谢组学检测小鼠血清中的脂肪酸。使用棕榈酸（palmitic acid, PA）诱导巨噬细胞极化，并通过定量PCR、蛋白质印迹和流式细胞术研究RFTN1的功能。通过免疫共沉淀、分子对接、双荧光素酶报告基因实验、棕榈酰化和磷酸化实验评估蛋白质相互作用及调控机制。在机制层面，研究人员证实STAT1通过结合Rftn1启动子直接抑制其转录。此外，RFTN1与ANXA5相互作用以稳定ANXA5并阻止其在溶酶体中的降解。RFTN1缺失导致ANXA5水平降低，PKM2（Y105）磷酸化增加，糖酵解增强，并促进M1极化。综上所述，该研究强调了RFTN1在HTG-AP中的关键作用，巨噬细胞中的RFTN1可能缓解HTG-AP。研究结果揭示了一条新的STAT1–RFTN1–ANXA5–PKM2信号轴，将脂质过载与巨噬细胞代谢重编程及炎症激活联系起来。靶向该通路可能为HTG-AP提供有前景的治疗策略。

论文解读

一、研究背景与问题

急性胰腺炎（acute pancreatitis, AP）是常见的消化系统急症，以胰腺炎症和全身炎症反应为特征，患者死亡率显著高于一般人群。高甘油三酯血症相关急性胰腺炎（hypertriglyceridemia-associated acute pancreatitis, HTG-AP）已成为我国AP的第二大病因，约占病例总数的20%–25%，且其发病率随代谢综合征和肥胖的流行而持续上升。临床研究显示，HTG-AP比其他病因亚型具有更高的重症化和全身并发症风险。

游离脂肪酸介导的脂毒性被广泛认为是HTG-AP的核心机制。过量的甘油三酯被胰脂肪酶水解，产生大量游离脂肪酸，诱导胰腺组织线粒体功能障碍、钙离子过载、内质网应激和炎症损伤。升高循环游离脂肪酸可通过JNK激活或TLR4/NF-κB信号使巨噬细胞向促炎性M1表型极化，从而加重胰腺坏死。然而，脂质过载与HTG-AP炎症放大之间的机制仍未完全阐明。

脂筏是富含胆固醇和鞘脂的微结构域，对膜运输和信号转导至关重要，可能协调免疫细胞的激活和功能。Raftlin（RFTN1）是一种脂筏支架蛋白，在胆源性AP中作为巨噬细胞极化的关键调节因子。研究人员前期研究发现，RFTN1缺失会破坏脂筏完整性并使巨噬细胞偏向M1表型。但RFTN1在HTG-AP中的功能仍不清楚。近期脂质组学分析显示HTG-AP具有不同于其他AP亚型的脂质组学特征，提示脂筏动力学在脂质过载微环境中可能存在显著差异。因此，该研究旨在探讨RFTN1在HTG-AP巨噬细胞极化中的作用，为HTG-AP提供新的机制见解和潜在治疗靶点。

二、主要技术方法

研究人员利用公共转录组数据集GSE194331（包含87例AP患者和32例健康对照的外周血转录组数据）和单细胞数据集GSE188819（包含2只健康小鼠和2只AP小鼠的胰腺单细胞转录组数据）进行多组学分析，采用基因集变异分析、无监督聚类、单样本基因集富集分析等方法评估脂筏信号活性。通过骨髓特异性Rftn1敲除（Rftn1^{flox/flox,lyz2-cre}）小鼠和野生型C57BL/6小鼠建立HTG-AP模型，小鼠购自大连医科大学实验动物中心及赛业生物（苏州），使用Poloxamer 407和雨蛙素诱导。通过靶向脂肪酸代谢组学检测血清脂肪酸谱。体外实验中，分离骨髓来源巨噬细胞（bone marrow-derived macrophages, BMDMs）并用棕榈酸（palmitic acid, PA）处理，运用定量PCR、蛋白质印迹、流式细胞术、免疫共沉淀、pull-down、分子对接、双荧光素酶报告基因、棕榭酰化（acyl-biotin exchange, ABE）检测和免疫荧光等技术阐明分子机制。

三、研究结果

1. 脂筏信号在AP中发生改变并与疾病严重程度相关

通过对GSE194331队列的分析，研究人员基于脂筏评分将患者分为三个亚组，发现脂筏评分随AP严重程度增加而逐步升高，表明脂筏信号活性与疾病进展密切相关。脂筏相关基因的表达谱在不同亚组间呈现显著差异，其中PPARG、SCARB1和RFTN1在亚组间差异表达，提示这些基因可能在AP发病中发挥调控作用。

2. RFTN1表达与脂筏活性和免疫景观重塑相关

RFTN1在各亚组间表达差异显著，且与脂筏信号评分呈显著负相关。单样本基因集富集分析显示，RFTN1表达与多种免疫细胞浸润相关，尤其与巨噬细胞丰度呈显著负相关。此外，AP患者RFTN1水平较健康对照显著降低，并随疾病严重程度增加呈逐渐下降趋势，表明RFTN1与脂筏评分、巨噬细胞浸润及疾病进展密切相关。

3. 单细胞分析揭示AP中脂筏信号通路的细胞类型特异性激活

对GSE188819数据集的单细胞分析鉴定出多种胰腺细胞类型，包括腺泡细胞、导管细胞、内皮细胞、巨噬细胞、B淋巴细胞、自然杀伤/T细胞和星状细胞等。与健康对照相比，AP样本中巨噬细胞比例明显扩张，提示炎症微环境增强。脂筏信号在不同细胞类型间呈现显著异质性，在内皮细胞和巨噬细胞中活性较高，且AP组巨噬细胞的脂筏评分较对照组显著升高。炎症相关信号评分在AP组与对照组间亦出现明显变化，进一步支持脂筏激活与炎症反应的密切关联。

4. RFTN1定义AP中发生代谢重编程的巨噬细胞亚群

对小鼠巨噬细胞进行降维聚类后，根据Rftn1表达情况将巨噬细胞分为RFTN1阴性和RFTN1阳性两个亚型。RFTN1阳性巨噬细胞表现出脂肪酸代谢、胆汁酸代谢和氧化磷酸化通路的增强激活，而TNF-α/NF-κB信号、IL6-JAK-STAT3信号和干扰素反应等促炎信号通路相对受到抑制。相反，RFTN1阴性巨噬细胞呈现与糖酵解相关的炎症激活转录特征。ANXA5在RFTN1阳性巨噬细胞中表达更频繁，提示RFTN1与代谢调节通路之间存在潜在联系。

5. RFTN1在HTG-AP小鼠胰腺中表达下调

研究人员建立HTG-AP小鼠模型后，HTG-AP小鼠表现出典型胰腺病理特征，包括腺泡水肿和炎症细胞浸润，病理评分显著升高，血清α-淀粉酶及血脂指标（总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇）明显升高。免疫荧光染色显示胰腺中F4/80⁺iNOS⁺巨噬细胞（M1表型）数量显著增加，炎症因子Il-1β、Il-6和Tnf-α的mRNA表达升高。RFTN1在HTG-AP小鼠胰腺中的基因和蛋白表达水平均显著低于对照组，提示RFTN1可能参与HTG-AP的进展。

6. 脂质过载诱导RFTN1下调并促进M1巨噬细胞极化加重HTG-AP

靶向脂肪酸代谢组学检测到HTG-AP小鼠血清中有19种脂肪酸显著升高，其中亚油酸（C18:2n6c）、棕榈酸（C16:0）和油酸（C18:1n9c）位列前三。研究人员选择棕榈酸进行体外研究。PA处理BMDMs后，M1巨噬细胞标志物（CD86和iNOS）表达显著增加，促炎细胞因子产生增多。THP-1来源巨噬细胞中也观察到类似结果。CD36作为脂肪酸关键转运体，在PA暴露下表达显著上调，伴随大量外源性PA进入细胞。PA刺激后巨噬细胞中RFTN1的基因和蛋白水平均显著下调，与HTG-AP小鼠胰腺组织中的表达趋势一致，表明CD36介导的脂肪酸摄取在高效脂肪条件下抑制RFTN1表达，可能促进巨噬细胞M1极化。

7. RFTN1缺失通过促进巨噬细胞M1极化加重HTG-AP

研究人员构建了骨髓特异性Rftn1敲除小鼠并诱导HTG-AP模型。单独Rftn1缺失在基础条件下不引起明显的胰腺损伤，但Rftn1–/–小鼠在HTG-AP诱导后表现出更严重的胰腺病变，表现为小叶间水肿、坏死和炎症细胞浸润。Rftn1–/–+HTG-AP小鼠血清甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇和α-淀粉酶水平高于HTG-AP组。F4/80⁺iNOS⁺巨噬细胞数量和炎症因子表达显著增加。从Rftn1–/–小鼠提取的BMDMs在PA刺激下表现出增强的M1极化和炎症基因表达，而恢复Rftn1表达可显著减弱PA诱导的M1极化和炎症反应，表明RFTN1在HTG-AP中作为巨噬细胞M1极化的负调控因子。

8. PA介导的STAT1棕榈酰化促进其磷酸化从而在脂质过载下抑制Rftn1转录

研究人员通过Promo、HOCOMOCO和Cistrome DB数据库预测Rftn1的转录因子，三个数据库取交集后仅鉴定出STAT1为共同候选转录因子。双荧光素酶报告基因实验证实STAT1显著降低Rftn1启动子活性，进一步截短和突变实验确定STAT1直接结合Rftn1启动子区域–751至–760位点发挥转录抑制作用。PA刺激显著增加BMDMs中STAT1磷酸化水平，而STAT1激活抑制剂氟达拉滨（fludarabine, FLU）可显著降低STAT1磷酸化并恢复RFTN1表达。Rftn1缺失不影响STAT1表达或磷酸化水平。ABE实验显示PA刺激大幅增加STAT1棕榈酰化水平。使用2-溴棕榈酸（2-bromopalmitate, 2BP）阻断棕榈酰化后，STAT1磷酸化水平显著降低，而RFTN1表达则相反，表明PA介导的STAT1棕榈酰化可促进其自身磷酸化，进而抑制RFTN1表达。

9. RFTN1稳定ANXA5以抑制PKM2依赖性糖酵解和M1极化

免疫沉淀联合液相色谱-串联质谱鉴定出176个候选RFTN1相互作用蛋白。根据巨噬细胞极化和脂肪酸转运相关功能，选择ANXA5、FABP5和PKC-α进行验证。免疫共沉淀和pull-down实验确认RFTN1与ANXA5直接相互作用，未观察到与FABP5或PKC-α的互作。分子对接预测RFTN1的Lys24（K24）残基在稳定与ANXA5的互作中发挥关键作用。将K24突变为丙氨酸（A）后，RFTN1与ANXA5的结合能力减弱，ANXA5蛋白水平降低，PA诱导的巨噬细胞M1极化和炎症反应增强。功能实验显示，PA处理显著增加巨噬细胞糖酵解活性。RFTN1缺失的BMDMs中ANXA5水平降低，PKM2（Y105）磷酸化水平升高。在Rftn1–/–巨噬细胞中过表达Anxa5可显著逆转PA诱导的PKM2（Y105）磷酸化并减弱M1极化和炎症因子产生。免疫荧光共定位实验表明，PA刺激下内化的ANXA5进入溶酶体，RFTN1缺失进一步增强了ANXA5与溶酶体的共定位，提示溶酶体降解加速了ANXA5的降解。

四、讨论与结论总结

讨论部分指出，HTG-AP以循环游离脂肪酸过量增加为特征，游离脂肪酸是腺泡细胞损伤和全身炎症放大的关键介质。研究者的转录组分析发现脂筏相关信号随疾病严重程度逐渐升高，单细胞分析显示脂筏信号在巨噬细胞中优先富集。Rftn1阳性巨噬细胞表现为脂质代谢活性增强和炎症信号减弱，RFTN1可能在AP中连接脂质代谢紊乱与巨噬细胞驱动的炎症反应。机制层面，脂质诱导的STAT1激活通过棕榈酰化依赖性磷酸化抑制RFTN1表达，RFTN1缺失通过增强溶酶体降解使ANXA5不稳定，导致PKM2依赖性糖酵解增强并促进M1极化，最终加重胰腺炎症。研究还发现CD36介导的脂肪酸摄取参与该过程。ANXA5被鉴定为RFTN1的直接互作蛋白，RFTN1通过Lys24残基与ANXA5特异性结合并稳定ANXA5。代谢重编程是巨噬细胞极化的关键决定因素，M1巨噬细胞主要依赖糖酵解，PKM2在Y105位点的磷酸化可增强糖酵解通量。RFTN1缺失通过促进ANXA5溶酶体降解导致PKM2激活和糖酵解重编程。

研究结论为：该研究鉴定出一条新的STAT1–RFTN1–ANXA5–PKM2信号轴，将HTG-AP中的脂质过载与巨噬细胞代谢重编程联系起来。研究结果凸显RFTN1是巨噬细胞极化的关键调节因子，靶向该通路可能为HTG-AP提供有前景的治疗策略。该研究发表于《Genes》。