内皮SIRT6–HIF-1α信号轴治疗性激活耦联血管生成与成骨并加速骨质疏松性骨折修复

《Genes & Diseases》：Therapeutic activation of endothelial SIRT6–HIF-1α signaling couples angiogenesis with osteogenesis and accelerates osteoporotic fracture repair

　　

骨质疏松性骨折（osteoporotic fractures）构成重大临床挑战，主要归因于血管生成受损、成骨缺陷以及二者功能性耦联的破坏。然而，能够同时恢复骨质疏松骨中血管再生与骨形成的治疗策略仍然匮乏。远程缺血预适应（remote ischemic preconditioning, RIPC）已被证实是一种非侵入性治疗策略，其通过诱导轻度低氧微环境稳定缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α），进而上调多种血管生成因子并促进组织修复，但其在骨质疏松性骨折修复中的作用及分子机制尚不明确。在本研究中，研究人员证明RIPC通过增强血管生成与成骨加速小鼠骨质疏松性骨折愈合。骨折骨痂组织蛋白质组学分析揭示SIRT6表达上调及SIRT6–HIF-1α信号轴显著激活。内皮特异性敲除SIRT6可消除RIPC的促再生效应。机制上，在低氧条件下，内皮祖细胞来源的SIRT6通过去乙酰化稳定HIF-1α，从而促进NOGGIN3和MMP9的分泌并增强成骨细胞介导的骨形成。反过来，成骨细胞来源的SLIT3和VEGF驱动内皮细胞向H型（H-type）表型分化，建立正反馈环路，将血管生成与成骨紧密耦联。为将上述发现转化为治疗应用，研究人员开发了包载MDL-800（一种选择性SIRT6激活剂）的骨靶向纳米颗粒，该纳米颗粒增强骨特异性递送，有效激活SIRT6–HIF-1α通路，并在体外（in vitro）和体内（in vivo）恢复血管生成–成骨耦联。综上所述，本研究鉴定内皮SIRT6–HIF-1α轴为RIPC诱导的血管生成–成骨串扰的核心调控因子，为治疗骨质疏松性骨折提供了一种有前景的、基于机制的策略。

一、研究背景与科学问题

骨质疏松性骨折是全球重大健康负担，随着人口老龄化和创伤性损伤发生率增加，其发病率持续上升，已成为中老年人群致残的主要原因，严重影响生活质量。骨质疏松性骨折以愈合延迟、生物力学完整性下降及不愈合风险升高为特征，常伴随慢性疼痛、功能障碍和反复住院，造成巨大的临床和社会经济成本。骨质疏松症中骨修复受损的关键病理特征在于血管生成–成骨耦联（angiogenic–osteogenic coupling）的破坏——这是一个对血管侵入、成骨祖细胞募集以及基质矿化的时空调控至关重要的紧密协调过程。该耦联失调导致血管灌注不足、骨痂形成缺陷和骨再生受损，从而阻碍骨折愈合。

病理生理学证据表明，骨质疏松性骨折发生于慢性低氧和血管化不良的微环境中，并因内皮功能障碍和对低氧的适应性反应迟钝而进一步恶化。缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α）是细胞适应低氧张力的主调控因子，协调血管生成、代谢重编程和成骨分化相关基因的转录。然而在骨质疏松背景下，由于氧化应激增强、慢性炎症和年龄相关信号失调，HIF-1α信号被显著抑制，导致新生血管化和成骨分化不足。尽管临床前研究表明通过遗传或药理学方法恢复HIF-1α活性可增强血管–骨耦联并改善骨折结局，但临床上安全有效激活该通路的可行策略仍然缺乏。

远程缺血预适应（remote ischemic preconditioning, RIPC）是一种以肢体短暂、重复性缺血再灌注为特征的非侵入性策略，最初在心血管和脑血管保护领域提出，现已因其广泛的再生潜力而受到认可。RIPC可增强组织对低氧应激的耐受性并促进新生血管化，从而营造有利于修复和再生的微环境条件。近期骨骼生物学研究提示RIPC可增强骨痂形成并上调骨折部位HIF-1α，表明低氧响应通路的激活可能是骨愈合的核心机制。然而，RIPC能否恢复骨质疏松骨中受损的血管–骨通讯，以及其分子机制，此前尚不清楚。

Sirtuin 6（SIRT6）是一种核内NAD⁺依赖性去乙酰化酶，已被定位为细胞适应代谢和环境应激的核心调控因子。在骨微环境中，SIRT6不仅增强成骨细胞分化、抑制破骨细胞介导的骨吸收，还强化内皮细胞功能和血管生成潜能，从而促进再生过程中的骨–血管耦联。机制上，SIRT6可直接与HIF-1α相互作用，在低氧应激下促进其去乙酰化和转录激活。这一SIRT6–HIF-1α调控轴将代谢重编程与血管化骨再生整合，为缺血和骨质疏松条件下的适应性反应提供了机制框架。然而，RIPC能否激活该通路以恢复骨质疏松性骨折中受损的骨–血管通讯，此前尚未被探索。

二、研究内容与主要发现

针对上述科学问题，研究人员开展了一系列体内外实验。首先建立去卵巢（ovariectomized, OVX）小鼠胫骨骨折模型模拟骨质疏松性骨折，并在骨折术后24小时开始每日RIPC干预。研究发现RIPC显著加速骨质疏松性骨折愈合，表现为骨痂体积增大、骨密度（bone mineral density, BMD）升高、骨小梁微结构参数改善、胶原沉积和软骨形成增加、骨折愈合率提高以及最大承载力和刚度显著增强。同时，RIPC显著增强骨折部位血管化，表现为血管重建显示新生血管增多，免疫荧光染色显示H型血管（CD31^hiEmcn^hi）富集，血清及骨痂中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）和骨钙素（osteocalcin, OCN）水平显著升高。

为阐明分子机制，研究人员对骨折后第14天骨痂组织进行定量蛋白质组学分析，共鉴定5546个蛋白，其中83个显著上调和38个显著下调。SIRT6是差异表达最显著的蛋白之一。基因本体（Gene Ontology, GO）富集分析显示差异蛋白显著富集于血管发育和血管生成相关生物学过程；京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路分析表明HIF-1α信号通路是最显著富集的通路之一。基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）进一步证实血管生成、低氧响应和HIF-1α信号相关蛋白在RIPC组显著富集。Western blot和免疫荧光染色证实RIPC处理后骨痂中SIRT6和HIF-1α表达显著升高，且SIRT6主要定位于血管内皮细胞。相关性分析显示SIRT6表达与HIF-1α、OCN和VEGF水平呈强正相关。

研究人员进一步探究RIPC促进内皮祖细胞（endothelial progenitor cells, EPCs）中SIRT6表达的循环介质。体外实验表明RIPC小鼠血浆可显著上调EPC中SIRT6表达，而去除细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）的血浆则消除了这一效应，纯化的RIPC来源外泌体可重现SIRT6上调。miRNA候选筛选鉴定miR-146a为关键功能性介质，其在RIPC来源外泌体中显著富集，并可在mRNA和蛋白水平促进SIRT6表达。

体外共培养实验证实EPC来源的SIRT6通过激活HIF-1α促进血管生成–成骨耦联。SIRT6过表达促进EPC增殖、迁移和管形成能力，上调CD31和EMCN表达，并增强骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）的碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）活性和钙沉积；SIRT6敲低则产生相反效应。机制研究表明SIRT6过表达上调SLIT3、VEGF、NOGGIN3和MMP-9的表达，而SLIT3/ROBO4和VEGF/VEGFR2信号阻断可消除SIRT6驱动的促血管生成和促成骨效应。

在低氧条件下，SIRT6与HIF-1α存在直接物理相互作用。共免疫沉淀（co-immunoprecipitation, Co-IP）实验证实二者结合。机制研究揭示SIRT6通过去乙酰化增强HIF-1α转录活性并抑制其降解，从而稳定HIF-1α。放线菌酮（cycloheximide, CHX）追踪实验表明SIRT6过表达延长HIF-1α半衰期，而SIRT6敲低加速其降解。

体内遗传学验证实验中，研究人员构建内皮特异性SIRT6敲除小鼠（Cdh5-Cre; Sirt6^fl/fl）并建立OVX骨折模型。结果显示RIPC在野生型（wild-type, WT）小鼠中显著增加BMD、骨体积（bone volume, BV）、组织体积（tissue volume, TV）和BV/TV比值，增强血管密度和H型血管形成，并上调OCN和VEGF表达；而内皮SIRT6缺失后，RIPC的这些促愈合效应被显著削弱或消除，证实内皮SIRT6是RIPC促骨折愈合效应的关键介质。

基于上述机制发现，研究人员开发了骨靶向纳米治疗策略。利用HEK293T细胞作为外泌体生产平台，通过无铜点击化学在外泌体表面功能化骨靶向ASP8肽，并负载选择性SIRT6激活剂MDL-800，构建MDL@BT-Exo纳米复合物。透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）确认纳米颗粒保持外泌体典型杯状形态，纳米颗粒追踪分析（nanoparticle tracking analysis, NTA）证实粒径分布均匀。Western blot验证外泌体标志物ALIX、CD63和CD81阳性，内质网蛋白calnexin阴性。体外摄取实验显示骨靶向外泌体被EPC摄取效率显著提高。药代动力学分析显示外泌体包载显著延长MDL-800的循环半衰期（MDL@BT-Exo：10.06 ± 1.32小时；游离MDL：5.06 ± 1.05小时）。体内分布实验显示MDL@BT-Exo在骨组织中随时间累积增加，骨髓中药物浓度更高且更持久。生物安全性评估显示主要器官无结构异常，肝肾功能指标无显著变化。

体外功能实验表明MDL@BT-Exo处理显著促进EPC增殖、迁移和管形成，增强CD31^hiEmcn^hi H型血管特征，并促进BMSCs成骨分化。体内治疗实验中，OVX骨折小鼠经MDL@BT-Exo治疗四周后，骨痂体积显著增大，皮质桥接更完整，BMD和BV/TV显著升高，胶原沉积和软骨形成增加，骨愈合率提高，最大承载力和刚度显著增强。血管重建显示血管密度和网络复杂性显著增加，H型血管在骨痂区域富集。分子水平上，MDL@BT-Exo处理促进Sirt6和Hif-1α表达，血清和骨痂中OCN和VEGF水平显著升高。

三、研究结论与意义

本研究系统阐明了RIPC通过激活内皮SIRT6–HIF-1α信号轴促进骨质疏松性骨折愈合的分子机制。研究发现RIPC通过循环外泌体miR-146a上调内皮细胞SIRT6表达，SIRT6通过去乙酰化稳定HIF-1α，进而促进NOGGIN3和MMP9分泌增强成骨细胞介导的骨形成；成骨细胞来源的SLIT3和VEGF驱动内皮细胞向H型表型分化，建立血管生成与成骨耦联的正反馈环路。基于此机制，研究人员开发了骨靶向MDL-800外泌体纳米递送系统（MDL@BT-Exo），在体外和体内有效激活SIRT6–HIF-1α通路，恢复血管生成–成骨耦联，加速骨质疏松性骨折愈合且无明显系统毒性。该研究不仅为RIPC的促再生效应提供了新的机制解释，还引入了一种具有转化前景的纳米治疗策略，为骨质疏松性及其他难治性骨折的治疗奠定了实验和理论基础。该论文发表在《Genes》期刊。