新型CDK19变异的鉴定及基于果蝇的体内功能证据支持其在神经发育障碍中的致病性

《Genetics in Medicine》：Identification of novel CDK19 variants and Drosophila-based in vivo functional evidence supporting pathogenicity in neurodevelopmental disorders

　　## 摘要### 目的CDK19（HGNC:19338）是一种中介体相关激酶，调节神经发育期间的转录。尽管 *CDK19* 变异已与神经发育障碍相关联，但其完整的表型谱和潜在的致病机制仍未完全明确。我们旨在进一步表征临床与遗传之间的相关性，并通过整合功能学和转录组学方法阐明疾病机制。### 方法通过国际合作，对 28 名携带 *CDK19* 变异的个体（12 名新鉴定，16 名先前报道）进行了系统性临床表型评估。为评估受累个体中鉴定的变异的功能后果，构建了表达 *CDK19* 等位基因的 *Drosophila*（果蝇）模型，并检查了其生存率、寿命、运动行为和癫痫易感性。通过蛋白质印迹、免疫荧光和幼虫脑部的 RNA 测序，评估了蛋白质稳定性、亚细胞定位、组织形态学和转录组改变。### 结果所有个体均表现出全面发育迟缓，语言发育迟缓是始终突出的特征；12 名个体中有 8 名（67%）患有癫痫，最常见的是婴儿癫痫痉挛综合征。6 名个体（50%）存在肌张力低下，颅面畸形和异常的脑部磁共振成像（MRI）发现也较为常见。数个致病等位基因表现出蛋白质稳定性降低、细胞核定位异常和组织毒性，伴随结构性异常，包括线粒体延长、肌原纤维增粗和肌节缩短。行为测定显示运动不协调和等位基因特异性癫痫易感性。RNA 测序发现突触和神经肌肉基因的一致性下调，包括 *GluRIIA*、*VGAT*、*nAChRβ1* 和 *Syn*，提示神经传递受损和神经肌肉接头完整性受损。这些发现在基于过表达的等位基因比较系统中获得，被视为支持变异致病性的功能性证据。### 结论这些发现证实并进一步细化了 CDK19 相关神经发育障碍的临床谱，并提供了体内功能证据，表明致病性 *CDK19* 变异与相关于突触和神经肌肉功能的转录程序破坏有关，支持 CDK19 功能障碍作为新兴的中介体复合物病谱系的一部分。## 引言神经发育障碍（NDDs）通常源于编码转录调节因子的基因的变异¹，这些因子在脑发育期间的突触形成、神经元分化和细胞类型指定中起关键作用²。这些基因对遗传扰动高度敏感^3,4，在关键发育窗口期破坏其功能可导致广泛的临床表型谱，从轻度智力障碍（ID）到严重的癫痫性脑病^5,6。中介体复合物是一种多亚基转录共激活因子，桥接基因特异性转录因子和 RNA 聚合酶 II，已成为 NDD 发病机制中的关键节点⁷，其多个亚基中的变异会导致具有重叠表型的不同疾病。CDK19（周期蛋白依赖性激酶 19，HGNC:19338）是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，构成中介体激酶模块的一部分，在那里调节 RNA 聚合酶 II 介导的转录⁸。它与编码尼宗 - 伊西多尔综合征（Nizon-Isidor syndrome，OMIM 618872⁹）和 Asadollahi-Rauch 综合征（Asadollahi-Rauch syndrome，OMIM 616789¹⁰）的基因所编码的其他亚基相互作用，包括 MED12L（HGNC:16050）和 MED13L（HGNC:22962）。其同源基因 CDK8（HGNC:1779）与 CDK19 共享约 91% 的序列同源性，在激酶和周期蛋白结合域中保守性尤其高¹¹。*CDK8* 和 *CDK19* 中的致病变异均导致重叠的 NDD 表型，包括 ID、肌张力低下和癫痫^8,12,13，反映了它们在脑发育期间转录调节中的共同作用。然而，与 CDK8 相比，CDK19 相关 NDDs 的机制基础仍未完全理解，因为系统性的功能研究和体内疾病模型有限。例如，功能丧失（LoF）和功能获得（GoF）机制均被涉及，正如 p.Gly28Arg 和 p.Tyr32His 变异对激酶活性产生相反影响的例子所示¹³，这强调了该疾病的等位基因异质性以及对系统性变异水平功能表征的需求。为解决这一差距，需要允许高效且可扩展地评估临床鉴定的 *CDK19* 变异的体内模型系统。尽管 CDK8 和 CDK19 共享结构相似性和 largely 重叠的相互作用伙伴¹⁴，但新兴证据表明这两个旁系同源基因之间存在背景特异性的非冗余性^15,16，表明某些 CDK19 功能可能无法完全由 CDK8 替代。这一区别与我们的 *Drosophila* 模型特别相关。*Drosophila* 缺乏直接的 CDK19 直系同源基因，而是编码一个单一的直系同源基因 *Cdk8*，该基因在功能上与两种人类旁系同源基因相关。虽然该系统不能完全重现人类 *CDK19* 遗传学，但它提供了一个保守的中介体激酶背景，在其中可以有意义地比较人类 *CDK19* 等位基因的体内效应。*Drosophila Cdk8* 与人类 *CDK19* 之间显著的结构和生化兼容性支持将果蝇作为比较人类 *CDK19* 等位基因相对表型效应的可行体内平台，而不是作为完整的遗传复制品^8,17,18。与此一致，*Drosophila Cdk8* 的扰动产生与神经发育相关的表型⁸，包括癫痫样行为、寿命缩短和突触异常，支持该模型在体内探究中介体激酶功能障碍方面的效用。在本研究中，人类 *CDK19* 变异通过 Gal4-上游激活序列（UAS）驱动的过表达引入 *Drosophila*，而内源性 *Cdk8* 保持完整。该设计并非旨在作为 *Cdk8* 功能丧失（LoF）救援实验；而是用作等位基因比较平台，以评估在等效遗传和表达条件下野生型和变异型人类 CDK19 构建体的相对效应。由于该模型依赖于在内源性 *Cdk8* 存在下的转基因表达，研究结果被解释为补充性功能证据，而不是人类 CDK19 疾病的完整遗传重建。通过国际合作，我们确定了携带新型 *CDK19* 变异的额外个体，并通过整合新收集和先前报道的案例细化了基因型 - 表型相关性。随后，我们应用该 *Drosophila* 等位基因比较系统评估选定 *CDK19* 变异在分子、细胞和有机体表型上的功能后果，旨在更好地界定变异水平的功能效应及其对 CDK19 相关 NDDs 的贡献。## 章节片段### 研究参与者和伦理批准12 名携带 *CDK19* 变异的个体于 2018 年至 2023 年间从多个国际中心招募。变异致病性根据美国医学遗传学和基因组学学会（ACMG）指南进行解读¹⁹。所有地点均获得当地机构审查委员会批准和书面知情同意。详细的机构隶属关系和伦理批准编号见伦理声明。### *Drosophila* 建模和分子克隆人类 *CDK19* 互补 DNA 构建体（NM_015076.5）被克隆### 来自 12 名新鉴定和 16 名先前报道病例的 CDK19 相关 NDDs 的临床表征我们确定了 12 名携带罕见杂合 *CDK19* 变异的参与者：p.Asp18Tyr, p.Gly28Arg, p.Gly28Glu, p.Ile59Thr, p.Arg112Cys, p.Lys153Arg (*n* = 2), p.Thr196Lys, p.Trp198Cys, p.Tyr199Cys, p.Ser402_Thr403del, 和 p.Gly420Arg（表 1^8,13,27,28 和补充数据）。除 1 名成人个体外，其余 11 名新鉴定个体的年龄从 1.2 岁到 16 岁不等（平均 6.3 岁），与先前报道病例的年龄分布（范围 0.75-25 岁，平均 7.3 岁）相当。### 讨论在本研究中，我们描述了 12 名携带新型 *CDK19* 变异的个体，并将他们的临床特征与先前报道的病例相结合，以进一步表征 CDK19 相关 NDDs 的基因型 - 表型谱。核心临床特征，包括全面发育迟缓（GDD）、癫痫、婴儿癫痫痉挛综合征（IESS）和肌张力低下，与先前报告 largely 一致，证实了 CDK19 相关表型在独立队列中的可重复性。本系列研究贡献了几个额外的## 利益冲突作者声明无利益冲突。## 致谢我们感谢参与者及其家庭参与和信任。作者感谢所有参与机构的敬业临床医生和护理人员提供的宝贵临床支持和协调。我们还感谢研究协调员、遗传咨询师和实验室人员在临床评估、样本处理和数据生成中的贡献。## 数据可用性支持本研究结果的数据可从## 作者Hyun Yong Koh | Ranjan K. Sahu | Sung Dae Kim | Tomomi Tanaka | Karampal S. Grewal | Jenny Zhe Liao | Yoon-Kyung Shim | Ria Garg | Ilona Krey | Viktoria Bothe | Krzysztof Szcza?uba | Emma Fosbinder | Olivier Patat | Matthew A. Lines | Lisette Leeuwen | Lauren Frazier | Mark Hannibal | Cassandra Starks | Esther M. Verheyen | Yuri A. Zarate | Hyung-Lok Chung## 单位贝勒医学院儿科系神经学与发展神经科学分部，德克萨斯州休斯顿