澳大利亚无刺蜂Tetragonula carbonaria蜂胶与蜂蜜的抗菌及抗真菌活性研究

《PLOS One》：The antibacterial and antifungal activity of honey and propolis from the Australian stingless bee Tetragonula carbonaria

　　

全球抗菌药物耐药性病原体的日益增多，激发了人们对蜂源天然产物作为新型抗菌物质来源的兴趣。尽管大多数研究集中于欧洲蜜蜂（Apis mellifera）产物，但全球分布的550种无刺蜂同样产生蜂蜜及其他蜂巢产物，代表了尚未充分开发的新型生物活性物质来源。本研究采用肉汤微量稀释法，检测了澳大利亚无刺蜂Tetragonula carbonaria蜂胶提取物及蜂蜜对16种临床重要细菌和真菌病原体的抗菌活性。T. carbonaria蜂胶和蜂蜜表现出截然不同的抗菌谱：蜂胶对部分细菌及特定丝状真菌具有选择性活性，而蜂蜜对所有受试细菌表现出广谱活性，并对皮肤癣菌具有选择性活性。T. carbonaria蜂蜜中H2O2的产生水平与其抗菌活性仅呈中等程度相关，蜂胶总酚含量与其抗菌活性亦无显著相关性，提示其他蜂源或植物源化合物是重要的活性贡献者。上述发现凸显了T. carbonaria蜂胶和蜂蜜作为有前景的抗菌物质及新型生物活性化合物潜在来源的价值。

论文解读：澳大利亚无刺蜂Tetragonula carbonaria蜂胶与蜂蜜的抗菌及抗真菌活性研究

一、研究背景与意义

抗菌药物耐药性的快速蔓延已成为严重的全球健康威胁，既往可治疗的感染日益难以控制。新型抗菌药物研发周期长、成本高昂，加之制药企业兴趣减退，新药管线严重受限。因此，迫切需要寻找具有确切疗效的替代抗菌来源，蜂源产物是其中颇具前景的方向之一。蜂胶是蜜蜂采集植物树脂与蜂蜡混合而成、用于构建和防护蜂巢的物质，蜂蜜则是以花蜜为原料经蜜蜂酶加工而成的营养丰富的甜味物质，二者的治疗特性自古已被认知，近年来因其广谱抗菌和抗真菌活性而重新受到医学界关注。

当前研究大多集中于欧洲蜜蜂（Apis mellifera）产物，而对其他蜂种的关注相对不足。无刺蜂（膜翅目，蜜蜂科：麦蜂族）是种类繁多、多样性高的大型社会性蜂类群体，全球估计约550种。蜜蜂与无刺蜂自7000万年前从共同祖先分化，两枝蜂类在生态和行为特征上存在诸多差异。澳大利亚分布有11种无刺蜂，其中Tetragonula carbonaria是分布广泛、管理成熟的物种，沿澳大利亚东海岸的热带、亚热带和温带气候区均有分布。澳大利亚原住民长期将无刺蜂产物用作传统药物，既重视其治疗应用，也珍视其深厚的文化意义。

与Apis mellifera蜂巢不同，无刺蜂巢由小型罐状蜂胶结构构成，用于储存蜂蜜和花粉。这种独特结构使蜂蜜与蜂胶罐壁紧密接触，可能促进生物活性化合物在两者间转移。T. carbonaria蜂胶含有多种植物源生物活性化合物，包括多酚类、萜类及芳香酸类；其蜂蜜则以高含水量（24–28%）和海藻酮糖（trehalulose）为主要糖类而与Apis mellifera蜂蜜相区别。既往研究已提示T. carbonaria蜂蜜和蜂胶具有强抗菌活性，但其对更广泛临床病原体尤其真菌的有效性尚未明确。本研究旨在系统表征T. carbonaria蜂胶和蜂蜜对多种临床重要细菌和真菌病原体的活性谱，并与Apis mellifera产物进行比较。

二、主要技术方法

研究人员从澳大利亚新南威尔士州和昆士兰州的多个蜂巢采集T. carbonaria蜂胶和蜂蜜样本，样本来自管理蜂群及两例野生蜂群（QLD1和QLD2，系从砍伐树木中营救）。蜂胶经液氮冷冻研磨后以70%乙醇提取，干燥后重悬于DMSO配制成100 mg/mL储备液。采用肉汤微量稀释法（broth microdilution）依据临床和实验室标准研究所（CLSI）标准方法测定最低抑菌浓度（MIC），测试对象包括16种临床重要微生物：3种革兰氏阳性菌、5种革兰氏阴性菌、3种酵母菌和5种霉菌。蜂蜜样本经稀释过滤灭菌后于0.8–25%（w/v）浓度范围测定；蜂胶提取物初测32–1000 μg/mL，后对部分敏感菌株补充1–32 μg/mL测定。蜂蜜中H₂O₂浓度使用低浓度过氧化物试纸条测定；蜂胶总酚含量采用Folin-Ciocalteu（FC）法测定，抗氧化还原能力采用铁离子还原抗氧化力（FRAP）法测定。统计分析使用GraphPad Prism v10.0.2，MIC值经对数转换后采用重复测量方差分析（repeated measures ANOVA）及Tukey多重比较检验，相关性分析采用Pearson或Spearman秩相关。

三、研究结果

1. T. carbonaria蜂胶对多种微生物表现出高度选择性抗菌活性

八份T. carbonaria蜂胶乙醇提取物对各微生物种的活性高度一致，呈统一无活性（MIC > 1000 μg/mL）或统一活性模式。蜂胶对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌（S. aureus）和粪肠球菌（E. faecalis）及革兰氏阴性菌大肠埃希菌（E. coli）具有活性，但对化脓性链球菌（S. pyogenes）及鲍曼不动杆菌（A. baumannii）、肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）、铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）和肠道沙门菌（S. enterica）无可检测活性。Apis mellifera蜂胶提取物（AM01）抗菌谱与之相同。抗菌MIC值范围为4–128 μg/mL，S. aureus最敏感（几何均值12 μg/mL），其次为E. coli（24 μg/mL）和E. faecalis（37 μg/mL）。抗真菌方面，蜂胶对霉菌少根根霉（R. oryzae）、犬小孢子菌（M. canis）和趾间毛癣菌（T. interdigitale）具有活性，但对光滑念珠菌（C. glabrata）、白色念珠菌（C. albicans）、新型隐球菌（C. neoformans）及黄曲霉（A. flavus）和烟曲霉（A. fumigatus）无活性。相比之下，AM01对所有受试酵母和霉菌均有活性。抗真菌MIC值范围为16–64 μg/mL，M. canis最敏感（几何均值20 μg/mL），其次为T. interdigitale（26 μg/mL）和R. oryzae（34 μg/mL）。细菌与真菌间的活性总体呈负相关，提示抗真菌活性化合物池可能与抗菌活性化合物池不同。蜂胶总酚含量为30.0–61.1 mg GAE/g，抗氧化还原能力为241.1–771.1 μmol Fe²⁺/g，二者强相关（r = 0.85；p < 0.001），但均与MIC值无显著相关。

2. T. carbonaria蜂蜜表现出广谱抗菌但选择性抗真菌活性

七份T. carbonaria蜂蜜样本初步筛选显示，所有样本对S. aureus和E. coli均有活性，但对C. glabrata和A. flavus无可检测活性（MIC > 25% w/v）。S. aureus（几何均值5.1% w/v）与E. coli（4.2% w/v）的敏感性无显著差异。因样本量有限，选取三份样本（NSW5、NSW6和NSW7）进行更广泛病原体测试。这些蜂蜜对所有受试细菌均有活性，包括革兰氏阳性菌S. aureus、E. faecalis、S. pyogenes及革兰氏阴性菌E. coli、A. baumannii、K. pneumoniae、P. aeruginosa、S. enterica。抗真菌谱较为复杂：所有样本对皮肤癣菌M. canis和T. interdigitale有活性，部分样本对酵母C. neoformans和霉菌R. oryzae有活性，所有样本对C. glabrata、C. albicans及A. flavus、A. fumigatus均无活性。H₂O₂检测显示多数样本为30 ppm，少数为3–10 ppm。H₂O₂浓度与S. aureus抗菌活性呈中等显著相关（r = 0.58；p = 0.01），但与C. neoformans无显著相关，提示H₂O₂虽贡献活性，但其他蜂源或植物源化合物可能发挥重要作用。

四、讨论与结论

T. carbonaria蜂胶和蜂蜜表现出与Apis mellifera产物不同的特异性抗菌谱。蜂胶对细菌的抑制谱与Apis mellifera蜂胶相似，但T. carbonaria蜂胶的抗真菌活性高度选择性，对皮肤癣菌强效而对酵母和曲霉无活性，这种物种特异性强效抗真菌活性在无刺蜂中亦属罕见。T. carbonaria蜂蜜则表现出广谱抗菌活性，MIC值与医用级麦卢卡（Manuka）和桉树（Jarrah）蜂蜜相当，且样本间活性一致性优于Apis mellifera蜂蜜。H₂O₂仅与抗菌活性中等相关，总酚含量和抗氧化能力与抗菌活性无显著相关，提示其他化合物如蜂源抗菌肽或特定植物来源化合物可能发挥关键作用。既往研究已鉴定Corymbia torelliana果实树脂中的黄烷酮为昆士兰T. carbonaria蜂胶的关键抗菌成分，但该树种分布范围有限，其他地区的蜂胶活性可能源于不同植物来源。T. carbonaria蜂胶和蜂蜜的窄谱强效抗真菌活性可能反映了进化压力——抑制食物储存中有害丝状真菌的同时允许有益菌群存在，这一假说值得进一步研究。

研究结论指出，T. carbonaria蜂胶和蜂蜜均是有前景的抗菌物质来源，其作用机制与Apis mellifera产物不同，且效力水平一致。虽然蜂蜜直接治疗应用可能受限于产量（每蜂群年产量约1 kg），但这些材料仍可作为鉴定新型生物活性化合物的重要线索。总体而言，该研究支持加强对本土蜂种作为尚未充分开发的抗菌物质来源的深入研究，以应对棘手的人类病原体问题。