达拉帕地（Darapladib）作为磷脂酶A2抑制剂抗多重耐药真菌病原体（包括耳念珠菌）的药物重定位研究

《PLOS One》：Repurposing the phospholipase A2 inhibitor, darapladib, to combat multidrug-resistant fungal pathogens, including Candida auris

　　

耳念珠菌是一种新出现的多重耐药真菌病原体，是全球主要的健康威胁，凸显了对新型治疗药物的迫切需求。研究人员筛选了约2600种FDA批准的药物和临床化合物，并鉴定出磷脂酶A2抑制剂达拉帕地（DAL）是一种针对多重耐药耳念珠菌的有效抗真菌剂。DAL对所有测试的耳念珠菌分离株均表现出抗真菌活性，并对其他测试的重要临床真菌病原体（包括其他念珠菌属、隐球菌属和毛霉菌病相关物种）显示出广谱活性，最低抑菌浓度（MIC）为4–16 μg/mL。DAL还对耳念珠菌表现出快速的杀菌活性，并与两性霉素B（AmB）对耳念珠菌和丝状真菌病原体具有协同作用。更重要的是，将耳念珠菌连续暴露于亚抑制浓度的DAL共16代，未产生可检测的耐药性。机制研究表明，DAL通过一种依赖于麦角固醇的膜靶向机制发挥作用，因为外源性麦角固醇减弱了其活性，而麦角固醇相关的单倍剂量不足突变体表现出敏感性降低。与该机制一致，DAL增加了膜通透性、核酸泄漏和活性氧（ROS）。在秀丽隐杆线虫-耳念珠菌感染模型中，DAL将耳念珠菌载量降至检测限以下。总之，这些发现支持进一步研究DAL作为一种重定位的抗真菌候选药物，用于治疗耐药真菌感染。

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研究背景与目的

侵袭性念珠菌病由念珠菌属引起，在全球范围内造成显著的医院获得性发病率和死亡率，尤其在重症监护病房中对免疫受损个体构成致命威胁。多重耐药念珠菌物种的出现，特别是耳念珠菌，因其可引起致死率高达30-60%的侵袭性感染而被视为全球健康威胁。耳念珠菌对主要抗真菌药物类别（如唑类、多烯类和棘白菌素类）的耐药性带来了重大治疗挑战，其中氟康唑耐药率超过90%，多烯类耐药率超过30%。尽管棘白菌素类耐药率相对较低（约5%）并被推荐为首选一线疗法，但全耐药耳念珠菌分离株已有报道，凸显了开发新型治疗方案的紧迫性。此外，导致侵袭性曲霉病和毛霉菌病的病原真菌常对现有抗真菌药耐药，且现有药物毒性限制了治疗选择。为应对这一未满足的医疗需求，研究人员对约2600种FDA批准的药物和临床化合物进行了高通量筛选，旨在发现可用于抗真菌治疗的潜在重定位药物。

研究方法概述

研究人员采用高通量筛选技术，使用包含约2600种化合物的药物重定位库，以16 μM终浓度对耳念珠菌AR0390进行初步筛选，以≥80%生长抑制率为阳性标准。随后通过CLSI标准微量肉汤稀释法测定最低抑菌浓度（MIC），利用棋盘格法和分数抑菌浓度指数（FICI）评估药物相互作用，采用时间-杀菌曲线评价杀菌动力学。通过碘化丙啶（PI）摄取实验评估膜通透性，利用NanoDrop分光光度计定量核酸泄漏，使用DCFH-DA荧光探针检测活性氧（ROS）水平。通过外源麦角固醇和胆固醇补充实验以及念珠菌白色念珠菌杂合缺失突变体分析探究作用机制。体内疗效评估采用秀丽隐杆线虫-耳念珠菌感染模型。

研究结果

鉴定DAL为新型抗真菌剂

通过药物重定位库筛选，研究人员鉴定出达拉帕地（DAL）为有效的耳念珠菌生长抑制剂。DAL对所有测试的10株耳念珠菌分离株均显示抗真菌活性（MIC = 8 μg/mL），并对其他念珠菌属、隐球菌属和毛霉菌病相关物种表现出广谱活性（MIC范围4–16 μg/mL）。时间-杀菌试验表明DAL在2小时内即对耳念珠菌表现出快速杀菌效应。

DAL与AmB对多种真菌病原体具有协同作用

棋盘格试验显示，DAL与两性霉素B（AmB）对耳念珠菌、曲霉属和毛霉菌病相关物种（根霉属、毛霉属和横梗霉属）表现出协同作用，ΣFICI范围为0.25至0.5。生长动力学实验进一步证实，DAL与AmB联合使用相比单药显著降低了毛霉和根霉的生长。

DAL敏感性在连续暴露后保持稳定

经过16代的连续亚抑制浓度暴露，耳念珠菌对DAL的MIC值未出现升高，表明耳念珠菌不易对DAL产生快速耐药性。相比之下，阳性对照5-氟胞嘧啶的MIC增加了超过500倍。

DAL不增加AmB对肾细胞的细胞毒性

使用Vero细胞进行的细胞活力测定显示，AmB单独处理组与DAL/AmB联合处理组的细胞活力无显著差异，表明DAL与AmB的协同抗真菌作用不会增加体外细胞毒性。

DAL与麦角固醇的相互作用提示其依赖麦角固醇的杀菌机制

外源性麦角固醇补充使DAL的MIC值升高4倍，时间-杀菌试验显示麦角固醇部分恢复了真菌生长并将DAL从杀菌活性转为抑菌活性。对31株白色念珠菌麦角固醇合成相关杂合缺失突变体的分析发现，其中9株突变体（涉及ERG26、ERG10、NCP1、ERG1、ERG27、ERG3、ARE2、ERG12和IDI1基因）对DAL的敏感性降低，进一步支持了DAL活性与麦角固醇的关联。

DAL引起膜通透化、核酸泄漏和ROS水平升高

DAL处理导致耳念珠菌呈剂量依赖性的质膜通透性增加（在2×、4×和8×MIC下分别增至对照的527%、1096%和1875%）、DNA泄漏增加（分别增至141%、225%和284%）以及ROS水平升高（在2×MIC下增至490%）。

DAL在外源性胆固醇存在下仍保持杀菌活性

外源性胆固醇补充使DAL的MIC仅升高2倍，而AmB的MIC升高4倍。时间-杀菌试验显示DAL在胆固醇存在下仍保持杀菌活性，而AmB则失去活性，表明DAL与胆固醇的关联弱于AmB。

DAL在秀丽隐杆线虫感染模型中的体内疗效

在秀丽隐杆线虫-耳念珠菌感染模型中，DAL处理可将感染线虫体内的活菌数降至检测限以下（低于Log₁₀ 1 CFU/mL），而伊曲康唑仅使菌量减少1.87 log₁₀ CFU。

讨论与结论

研究结果表明，达拉帕地（DAL）是一种有前景的抗真菌化合物，对测试的真菌分离株具有杀菌、广谱和体内疗效。DAL对耳念珠菌未观察到耐药性发展。其作用机制是通过与真菌膜中特有的麦角固醇相互作用，导致膜通透性增加、核酸泄漏和ROS产生，最终引起细胞死亡。DAL与两性霉素B（AmB）的协同作用可能源于DAL诱导的膜扰动增强了AmB的膜破坏活性。重要的是，DAL对胆固醇的结合较弱，且在胆固醇存在下仍保持杀菌活性，提示其可能具有优于AmB的安全性。此外，DAL在临床前研究中已表现出良好的安全性和药代动力学特性，这为其抗真菌重定位提供了优势。研究结论指出，DAL作为一种磷脂酶抑制剂，其化学结构为进一步修饰以提高疗效、防止耐药性发展和改善药代动力学特性奠定了基础。有必要开展进一步研究以确定磷脂酶A₂抑制剂作为抗真菌治疗药物的可行性。