肠内分泌细胞中Auxilin通过细胞间信号中继调控肠道稳态

《PLOS Genetics》：Auxilin in enteroendocrine cells controls intestinal homeostasis through inter-cell signaling relays

　　

成体干细胞对驻留组织稳态和机体适应度的维持至关重要。驻留干细胞必须持续感知外部和内部信号，并相应地调整其增殖速率，以避免无限增殖或过早分化。然而，分化细胞如何通过细胞间通讯影响干细胞增殖和组织稳态，目前仍知之甚少。在此，研究人员揭示了Auxilin（Aux）在肠内分泌细胞（enteroendocrine cells，EEs）中通过限制肠道干细胞（intestinal stem cell，ISC）增殖而发挥的前所未有的功能。在所有EEs中敲低aux会导致肠道稳态破坏。在aux缺失的EEs中，Slit水平显著降低，而在部分aux缺失的EEs及邻近野生型肠上皮细胞（enterocytes，ECs）中，细胞因子Upd3的表达显著升高。在prosts?>?auxRNAi肠道中异位表达slit可有效挽救所观察到的缺陷。值得注意的是，由于aux缺失的EEs中EGFR的累积，EGFR信号被异位激活。进一步抑制EGFR信号可完全抑制prosts?>?auxRNAi肠道中的缺陷。最后，EGFR信号通过Pointed与slit调控区结合来抑制slit的转录。综上，这些数据表明，EEs中的Aux通过细胞间通讯抑制ISCs过度增殖和异常后代分化，从而维持肠道稳态。因此，本研究揭示了在组织稳态和肿瘤发生过程中，分化细胞如何通过细胞间信号中继来正确调控干细胞增殖的潜在机制。

论文解读：肠内分泌细胞中Auxilin通过细胞间信号中继调控肠道稳态

一、研究背景与科学问题

成体干细胞是维持驻留组织稳态和机体适应度的关键。干细胞必须持续感知外部环境信号和内部生理条件，并相应调整其增殖速率，以在自我更新和分化之间维持精确平衡。一旦干细胞增殖与后代分化之间的平衡被打破，将导致干细胞过度累积或过早耗竭，进而引发组织稳态失衡和病理发生。在成体肠道中，肠道干细胞（intestinal stem cells，ISCs）负责持续补充终末分化的肠上皮细胞，维持肠道的正常生理功能。然而，分化细胞如何通过细胞间通讯反向调控干细胞增殖和组织稳态，这一关键科学问题长期未获解答。

果蝇成虫后肠是研究干细胞调控和细胞间通讯的理想模型。其后肠上皮为单层上皮，主要由吸收性肠上皮细胞（enterocytes，ECs）构成，肠道干细胞（ISCs）、成肠细胞（enteroblasts，EBs）、EE前体细胞（EE progenitors，EEPs）和肠内分泌细胞（enteroendocrine cells，EEs）散布于基底膜上。ISCs通过不对称分裂实现自我更新并产生分化为ECs和EEs的后代细胞。此前研究已表明，源自EEs的Slit-Robo信号可调控ISC谱系中的细胞命运决定，但EEs如何与ISCs通讯以控制ISC增殖和后代分化、从而维持肠道稳态的机制仍不清楚。

Auxilin（Aux）是一种含DnaJ结构域的分子伴侣，与ATP酶Hsc70协同参与网格蛋白包被囊泡（clathrin coated vesicles，CCVs）的解聚。研究人员此前发现Aux在ISCs中通过内吞介导EGFR的清除以限制EGFR信号，从而维持肠道稳态；在ECs中Aux通过介导细胞黏附分子的ER-高尔基体运输维持EC完整性。然而，Aux是否以及如何在EE-ISC通讯中发挥作用，仍是未解之谜。本研究旨在阐明Aux在EEs中调控ISC增殖和后代分化的机制。

二、研究内容与主要结论

本研究揭示了EEs中的Aux通过至少两条信号中继通路非细胞自主地限制ISC增殖和后代分化，从而维持肠道稳态。在生理条件下，Aux在EEs中与EGFR结合并促进其内吞和降解，确保EEs中EGFR信号保持微量或不被激活，从而允许slit正常转录，Slit蛋白从EEs分泌后激活ISCs中的Robo信号，抑制ISC过度增殖和异常分化。当EEs中aux缺失时，EGFR无法被内吞而在EEs质膜上累积，导致EGFR信号异位激活；激活的EGFR信号通过转录因子Pointed（Pnt）直接结合slit调控区，抑制slit转录，导致Slit蛋白水平降低，Slit-Robo信号受损；同时，部分aux缺失的EEs及邻近野生型ECs中细胞因子Upd3表达显著升高，激活ISCs中的JAK/STAT信号，促进ISC过度增殖。在Slit-Robo信号受损和JAK/STAT信号激活的协同作用下，ISCs摆脱增殖抑制，发生过度增殖和异常后代分化，最终导致肠道稳态破坏和病理发生。

三、关键技术方法

本研究主要采用了以下关键技术方法：利用果蝇遗传学工具，通过pros^ts（pan-EE驱动子）和CG32547Gal4等EE特异性驱动子结合tubGal80^ts温度敏感系统实现基因的时空特异性敲低和过表达；采用免疫荧光染色和共聚焦显微镜成像技术检测各细胞类型标志物（Dl、Pros、esg-lacZ、Gbe+Su(H)-lacZ等）及信号通路活性（pERK、Slit、EGFR等）；利用slit-lacZ和Upd3-lacZ报告基因检测基因转录水平；通过染色质免疫沉淀结合定量PCR（ChIP-qPCR）检测转录因子Pnt与slit调控区的直接结合；采用qRT-PCR检测基因表达水平。样本均取自雌性果蝇后肠R5区域。

四、研究结果

1. Aux在所有EEs中对肠道稳态是必需的

通过Aux特异性抗体检测发现Aux在包括EEs在内的多种肠道细胞中均有表达。在所有EEs中敲低aux导致果蝇寿命缩短、肠道整体增大、肠道细胞数量显著增加。esg-lacZ⁺祖细胞、Dl⁺ISCs、Pros⁺EEs和Gbe+Su(H)-lacZ⁺EBs数量均显著增加，有丝分裂细胞（pH3⁺）数量也明显增多。共表达UAS-aux-flag-GFP可完全挽救这些缺陷。通过对照实验排除了aux在ISCs或中枢神经系统中敲低导致表型的可能性，并利用CG32547Gal4这一新鉴定的pan-EE驱动子验证了表型的特异性。此外，在特定EE亚型（如Tk⁺、amon⁺、386Y⁺亚型，各占EEs总数的40%–49%）中敲低aux未观察到明显缺陷，表明Aux在所有EEs中发挥功能。

2. Slit-Robo信号受损和JAK/STAT信号激活导致Aux缺失后的缺陷

在aux缺失的EEs中，Slit蛋白水平显著降低，祖细胞中Slit信号也相应减弱。在所有EEs中敲低slit或在祖细胞中敲低robo2可部分模拟aux缺失的表型。同时，Upd3-lacZ在部分aux缺失的EEs及邻近野生型ECs中表达显著上调。在aux缺失的肠道中异位表达slit可有效挽救所观察到的缺陷，表明Slit-Robo信号受损和JAK/STAT信号激活共同导致了ISC过度增殖和异常后代分化。

3. Aux通过介导EGFR内吞抑制EEs中的EGFR信号

在对照肠道中，EGFR信号（pERK）仅在祖细胞中激活，EEs中检测不到。在aux缺失的EEs中，EGFR蛋白异常出现在质膜上，pERK信号异位激活。阻断EEs中的内吞作用可模拟aux缺失的表型。在EEs中异位激活EGFR信号可重现aux缺失导致的祖细胞大量累积，而同时在aux缺失的EEs中敲低Egfr可完全抑制这些缺陷，表明异位激活的EGFR信号是aux缺失表型的主要原因。

4. EGFR信号直接抑制slit的表达

在EEs中异位激活EGFR信号导致Slit蛋白水平降低，而阻断EGFR信号则使Slit蛋白水平升高。slit-lacZ报告基因检测显示，aux缺失或EGFR信号激活时slit转录显著降低，而阻断EGFR信号时slit转录升高。在aux缺失的EEs中异位表达slit可抑制Raf^gof诱导的祖细胞增殖表型，表明slit作用于EGFR信号下游。ChIP-qPCR结果显示，EGFR信号下游转录因子Pnt直接结合slit转录起始位点（TSS）附近的两个推定结合基序（Motif 1和2），直接抑制slit转录。

五、讨论与结论

本研究揭示了EEs中的Aux通过细胞间信号中继调控ISC增殖和后代分化的分子机制。在生理条件下，Aux促进EGFR内吞和降解，确保EEs中EGFR信号不被激活，从而维持slit正常表达；Slit蛋白从EEs分泌后激活ISCs中的Robo信号，抑制ISC过度增殖。当EEs中aux缺失时，EGFR在质膜累积导致EGFR信号异位激活，Pnt直接结合slit调控区抑制其转录，导致Slit-Robo信号受损；同时，部分aux缺失的EEs及邻近野生型ECs中Upd3表达升高，激活JAK/STAT信号促进ISC过度增殖。此外，aux缺失的EEs可能分泌尚未鉴定的弥散性因子X，作用于ECs导致其死亡并分泌Upd3，进一步放大JAK/STAT信号。在Slit-Robo信号受损和JAK/STAT信号激活的协同作用下，ISCs发生过度增殖和异常后代分化，导致肠道稳态破坏。该研究揭示了分化细胞通过细胞间信号中继正确调控干细胞增殖的机制，鉴于这些信号分子和调控机制在进化上的保守性，该发现可能对哺乳动物组织稳态和肿瘤发生的理解具有重要参考价值。