《PLOS Genetics》：Extensive mobilome heterogeneity in a widespread endosymbiont: A candidate dimeric plasmid and highly fragmented prophages in Wolbachia from Culex pipiens
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专性胞内细菌Wolbachia因其对宿主节肢动物繁殖的自私性修饰、对宿主进化的影响，以及在减少全球虫媒病毒传播的媒介控制工作中的效用而日益受到关注。尽管其基因组高度缩减，Wolbachia仍携带丰富的移动组（mobilome），在蚊媒中包括噬菌体（phage）
专性胞内细菌Wolbachia因其对宿主节肢动物繁殖的自私性修饰、对宿主进化的影响，以及在减少全球虫媒病毒传播的媒介控制工作中的效用而日益受到关注。尽管其基因组高度缩减，Wolbachia仍携带丰富的移动组（mobilome），在蚊媒中包括噬菌体（phage）、插入序列（IS）和质粒（plasmid）。然而，这些富含重复的移动遗传元件（MGEs）以难以组装著称，并可产生掩盖其真实多样性的人工嵌合序列。因此，传统基因组测序和组装方法常常无法解析其复杂性，留下关于这些元件如何进化、移动并塑造共生菌和宿主基因组的关键知识空白。为应对这些挑战，研究人员建立了一种新型Oxford Nanopore长读长测序（long-read sequencing）策略，该策略避免预先PCR扩增，并利用单只解剖的雌性卵巢。利用该方法，研究人员直接从天然长读长分子中报道并表征了来自蚊媒Culex pipiens molestus单个卵巢的首个近完整Wolbachia基因组及其移动元件。来自同一品系个体的额外短读长（short reads）用于评估和验证候选突变，尤其是在重复区域。研究人员报道了pWCP质粒的一种新二聚体（dimeric）结构，提示存在可能与活跃复制相关的多聚体（multimeric）质粒形式。研究人员还观察到，尽管采用长读长测序，前噬菌体（prophage）WO区域仍广泛片段化，凸显其结构复杂性。原始长读长分析在WO区域内恢复了多个可变基因共线性（gene synteny），指向组装遗漏的异质性前噬菌体架构，以及Culex pipiens（wPip）群菌株Wolbachia中WO元件的显著多样性。综上，研究结果揭示由整合型和游离型移动元件塑造的内共生菌基因组结构异质性。
研究背景与问题：Wolbachia是广泛存在的专性胞内α-变形菌（Rickettsiales），可通过细胞质不亲和（CI）等方式操纵宿主繁殖，并影响宿主病原易感性。其移动组（mobilome）包含噬菌体、质粒、插入序列和转座子等，是基因组可塑性的重要驱动因素。然而，重复丰富的移动遗传元件（MGEs）难以准确组装，传统测序和组装易产生嵌合或折叠错误，导致WO前噬菌体（prophage）区域、质粒结构及拷贝数等信息被低估。Culex pipiens复合体是研究CI和媒介控制的重要系统，但此前仅有的wPip参考基因组均存在片段化或组装塌缩，尤其cifA-cifB等多拷贝位点可能被错误表示为单拷贝。因此，研究人员需要一种减少PCR偏倚、可解析单一个体Wolbachia及MGE精细结构的方法。研究人员对单只孕卵Culex pipiens molestus雌蚊卵巢进行无预扩增Oxford Nanopore长读长测序，并结合同品系额外卵巢Illumina短读长验证，重建了wPipCelG基因组，发现候选二聚体pWCP质粒、单体和多聚体质粒形式共存，以及比现有参考更复杂、更多样的WO前噬菌体结构。该研究强调现有组装可能低估Wolbachia宿主内异质性和移动组多样性，并为在组装独立层面评估重复富集区域提供策略。
关键技术方法：样本为2023年法国Montpellier采集的Culex pipiens molestus Celestin株实验室群体。研究人员用qPCR（定量PCR）评估卵巢Wolbachia及MGE丰度，用FISH（荧光原位杂交）定位Wolbachia；对单只孕卵雌蚊卵巢行无预扩增Oxford Nanopore长读长测序，Flye组装，anvi’o注释与人工精炼，Proovframe校正开放阅读框，并进行泛基因组和系统发育分析；对原始长读长进行映射和共线性分析；用同品系另三对卵巢Illumina短读长验证候选突变；用OriV-Finder预测质粒oriV（质粒复制起点）。
研究结果：
1. Ovaries with high Wolbachia abundance were selected for genome sequencing（高Wolbachia丰度卵巢用于基因组测序）：qPCR显示Celestin株孕卵卵巢中wsp/ace2平均43.1拷贝/宿主基因组当量；pWCP基因GP11平均1.7拷贝/Wolbachia，WO连接器/基板模块标记GPW平均9.5拷贝/Wolbachia；FISH显示Wolbachia广泛分布于卵巢，围绕卵母细胞核并见于滤泡细胞，支持该组织适合长读长重建。
2. Nanopore sequencing of a single ovary sample for the reconstruction of wPipCelG genome（单卵巢样本Nanopore测序重建wPipCelG基因组）：单卵巢测序获309,559条reads，中位长度1,223 bp，最大119,034 bp；lambda校准平均read准确率94.95%。初始MAG含24个contig，完整度91.5%、冗余1.4%；与wPipPel、wPipJHB、wPipMol的ANI分别为99.84%、99.83%、99.63%，六基因系统发育归入wPip-I。泛基因组1,166个基因簇，wPipCelG与三参考共享1,056簇，10簇独有、8簇缺失。人工精炼去除10个低覆盖或冗余contig，保留14个contig；contig_2约1,186,930 bp为核心基因组，contig_9为18,485 bp二聚体pWCP，其余12个含WO前噬菌体区域。
3. pWCP plasmid is recovered as a dimeric structure（pWCP质粒以二聚体结构恢复）：contig_9为18,485 bp，约为单体pWCP参考9,228 bp的两倍，由两个完整pWCP单元同向头尾串联组成，与参考99.77%一致；VNTR（可变数目串联重复）区有16-nt插入，使16-bp重复由6拷贝增至7拷贝，另有插入、缺失和C→T差异。Illumina短读长表明部分indel源于Nanopore均聚区碱基识别错误；VNTR内C/T差异更可能由额外重复单元造成比对歧义，而非真实点突变。
4. Long reads support the coexistence of monomeric and multimeric plasmid forms（长读长支持单体与多聚体质粒形式共存）：24条>9,000 bp、MAPQ=60的长读长比对contig_9，read准确率94.53%；4条>14 kb reads符合二聚体/多聚体，20条<11 kb符合单体；read 1（22,496 bp）和read 2（19,413 bp）覆盖超过单体两倍，支持串联组织；read 3（18,092 bp）连续比对14,123 bp后其余区域带缺口匹配pWCP；部分reads可能来自仅部分测通的大多聚体环状结构。
5. The observed plasmid structures may be associated with plasmid replication（观察到的质粒结构可能与质粒复制相关）：多数质粒reads起止位置随机，但Read 5（10,328 bp）和Read 6（10,322 bp）长度近同、方向相反且起止位置相同，提示可能来自正在复制、呈卷曲构象的单分子正反链；其重叠区域与双链质粒经theta样机制复制相符。Read 7（10,204 bp）呈约400 bp反义区、同义重复、其余质粒序列及额外初始同义拷贝的复杂结构，也支持复制相关中间体。OriV-Finder在pWCP参考6,363–6,513 bp预测II型oriV，重叠VNTR 16-bp串联重复并具iteron复制起始特征；组装多聚体、长读长异常结构和预测oriV共同与复制相关质粒结构一致。
6. Wolbachia and WO genomes exhibit complex structural organization（Wolbachia与WO基因组呈复杂结构组织）：contig_2平均覆盖约30X，oriC位于426,616–427,120 bp；噬菌体富集区 recovered为12个较小contig，显示高度重复前噬菌体组装困难。片段化前噬菌体远离oriC；大丝氨酸重组酶系统发育将wPipCelG WO归入sr3WO分支（Bordenstein & Bordenstein (2022)）。contig_2两端含噬菌体相关基因，包括Type IX cifB（6,131–8,827，对应wPipPel WP0462）及两个头部结构基因；末端含部分Octomom样区域，具毒性相关结构域、预测真核样毒素WP1346、WP1348和部分WP1349，间插转座酶WP1345、WP1347，类似wPipPel。部分长读长同时比对contig_2末端噬菌体区和contig_10、contig_22，但因重复序列比对歧义，未能解析精确结构或整合状态。
7. WO phage regions exhibit extensive structural rearrangements（WO噬菌体区域呈广泛结构重排）：七个最长WO富集contig中，几乎均见核心噬菌体基因侧翼EAM（真核关联模块）；多数contig覆盖不均，提示重复基因非特异招募reads，少数如contig 3、contig 22覆盖近均一。按结构模块估算，头部和连接器/基板基因约6–7拷贝，尾和尾纤维基因约3–5拷贝，提示多个完整和残存前噬菌体。Type I cif基因平均4拷贝，均位于contig_10；Type IV cif为单拷贝，亦在contig_10；Octomom样区域单拷贝位于contig_2末端；转座酶11个基因簇，IS982最高，预测56拷贝。原始≥10 kb长读长中，6条同时携带WOPip1和WOPip5注释，支持二者在wPipCelG相邻或重排，而wPipPel中不连续；并见wPipPel缺失的转座酶WP1350。Type I cifA-cifB见三种构型：两种cifB截短的回文结构（分别8和7条reads支持）和一种全长串联（4条reads支持）；两种回文侧翼不同，一侧均共享mutL-rnhA-PPDEXK2，另一侧分别为PPDEXK2-intII-rnhA或PPDEXK2-intII后接WO-PC2相关区；合计5个cifA-cifB实例。Type IV见经典串联（8条reads）和cifA-cifB-cifB-cifA回文（1条read）。以Type I cifA（WP0282）为中心的邻接图显示多个基因顺序构型，与WO区覆盖不均和contig片段化一致。
讨论总结与结论翻译：讨论指出，单雌卵巢无扩增长读长策略减少扩增偏倚和个体混合，能直接捕获难获取的移动组形式；pWCP单体和候选二聚体提示其可能为高度动态移动组中的自复制元件，但现有数据不能排除重组或技术伪影。WO相关区域比现有wPip参考更复杂多样，单一宿主内多种结构变异共存提示现有组装可能低估Wolbachia种群内异质性；即便优化长读长，重复WO区仍部分未解析。结论翻译：本研究说明，在分析内共生菌基因组中高度重复且易发生结构复杂化的移动区域时，批判性评估组装输出十分重要。在可行情况下，结合长读长与短读长数据，并直接检查原始reads和覆盖谱，为以独立于组装的方式研究生物学基因组特征提供了有价值策略。在本研究中，无预扩增长读长测序使研究人员能够直接获取单一个体基因组信息，而来自额外样本的短读长测序帮助修正和验证质粒组装。借此，研究人员提供了Culex pipiens molestus中Wolbachia的新基因组组装，并在基因组水平（部分WO富集区仍未完全解析）及宿主组织原位可视化层面进行了表征。此外，观察结果进一步说明Culex pipiens中Wolbachia基因组尤其是其移动组的动态性。质粒和噬菌体元件的结构变异性支持这些组分可能在该共生菌基因组可塑性中持续发挥重要作用。尤其pWCP元件在此被提示为候选复制性质粒，携带功能性复制起点并以单体和二聚体形式出现，但研究人员对此解释保持谨慎，因为不能完全排除未表征技术伪影。这些发现呼应先前提示：尽管胞内基因组通常精简，MGE的获得和活动可能作为Wolbachia多样化和适应潜力的来源，部分抵消其胞内生活方式带来的缩减压力。
