靶向Nur77/LYSET轴的首创新型甲硫亡诱导剂NLM1：克服顺铂耐药的非小细胞肺癌治疗策略

《Acta Pharmaceutica Sinica B》：A first-in-class methuosis inducer targeting Nur77/LYSET axis for the treatment of non-small cell lung cancer, irrespective of cisplatin resistance

　　

非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）仍是严峻的临床挑战，亟需新的治疗策略。代谢重编程是公认的癌症标志，常伴随巨胞饮（macropinocytosis，MPC）活性升高。甲硫亡（methuosis）是一种由MPC失调引起的独特非凋亡性细胞死亡形式，近期已成为颇具前景的抗癌机制。核受体Nur77是肿瘤代谢与进展的关键调控因子，但其在甲硫亡中的作用此前尚未被探索。本研究鉴定出一种新型Nur77配体（NLM1），作为首创性甲硫亡诱导剂，对NSCLC具有强效活性。机制上，NLM1特异性结合Nur77配体结合域（ligand-binding domain，LBD）的B位点，损害Nur77/LYSET通路，减少溶酶体水解酶，阻断巨胞饮体降解，并触发甲硫亡性细胞死亡。同时，Nur77的激活功能2（activation function 2，AF2）结构域和LYSET的LKAQLL基序被鉴定为Nur77与LYSET蛋白-蛋白相互作用的关键结构元件。值得注意的是，NLM1在顺铂敏感和顺铂耐药的NSCLC模型中均表现出显著的抗肿瘤疗效，且具有可接受的药代动力学特征和安全性。本研究确立了Nur77作为诱导甲硫亡的 promising 靶点，并将NLM1定位为NSCLC（无论是否具有顺铂耐药）的开创性治疗候选药物。

论文解读：靶向Nur77/LYSET轴的首创新型甲硫亡诱导剂NLM1——非小细胞肺癌治疗的新策略

一、研究背景与科学问题

非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）约占肺癌总数的85%，因预后差、五年生存率低而构成重大临床挑战。肿瘤微环境富含大分子蛋白质但缺乏游离氨基酸，加之异常血管化和升高的间质压，限制了癌细胞通过质膜转运体获取营养。为应对营养匮乏，癌细胞发生代谢重编程，其中巨胞饮（macropinocytosis，MPC）活性上调是重要策略之一。MPC是一种进化上保守的非特异性液相摄取内吞途径，被多种致癌驱动因素（如K-Ras、c-Src、EGFR突变及Wnt或Hippo信号激活）上调。癌细胞利用MPC内化胞外蛋白、坏死碎片、死亡受体（death receptors，DRs）和细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs），获取氨基酸、碳水化合物和核苷酸等小分子营养物及功能性生物大分子，以支持生存、促进增殖和转移，并参与耐药形成。MPC因此被视为肿瘤学中颇具前景的治疗靶点。

甲硫亡（methuosis）是一种由MPC失调引起的独特非凋亡性细胞死亡形式，以源自巨胞饮体的大型充液空泡积聚为特征。甲硫亡不受自噬、凋亡或坏死抑制剂影响，是诱导癌细胞死亡的理想替代机制。然而，已有甲硫亡诱导剂（如CX4945、PFK158、MOMIPP、化合物13、12A及epimedokoreanin C）因机制不清和成药性差而阻碍了临床转化。溶酶体水解是巨胞饮体降解的关键步骤，溶酶体酶转运因子（LYSET，又称TMEM251或GCAF）是水解酶转运和成熟的关键跨膜蛋白，其缺乏可减少溶酶体水解酶并损害巨胞饮体和自噬体降解，从而抑制肿瘤生长。但迄今尚无靶向LYSET通路的小分子甲硫亡诱导剂报道。核受体Nur77（NR4A1）在NSCLC组织中过表达，其高表达与不良临床病理特征和较差生存显著相关，但Nur77在甲硫亡中的作用此前未被探索。因此，开发机制明确、成药性良好的新型甲硫亡诱导剂，并阐明Nur77在其中的角色，是NSCLC治疗领域的迫切需求。

二、主要技术方法

研究人员综合运用了多种关键技术：细胞活力检测（MTT法）和集落形成实验评估抗增殖活性；透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM）观察亚细胞结构；免疫荧光染色和共聚焦显微镜分析蛋白定位与共定位；免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，co-IP）验证蛋白相互作用；表面等离子共振（surface plasmon resonance，SPR）和荧光淬灭实验测定结合亲和力；双荧光素酶报告基因实验评估核受体转录激活；RNA测序（RNA-Seq）和基因集富集分析（GSEA）解析转录组变化；X射线晶体学解析共晶结构；Seahorse代谢通量分析检测氧化磷酸化和糖酵解；斑马鱼胚胎及BALB/c裸鼠异种移植瘤模型（H460、A549及顺铂耐药A549/DDP）评估体内抗肿瘤疗效；Sprague–Dawley大鼠用于药代动力学（pharmacokinetic，PK）评估，KM小鼠用于组织分布研究。细胞系来源包括美国典型培养物保藏中心（ATCC）、Procell（中国）、中国科学院上海细胞库等。

三、研究结果

3.1 NLM1在NSCLC细胞中强效诱导甲硫亡

研究人员首先评估了10种NSCLC细胞系和2种正常肺细胞系的MPC活性，发现正常肺细胞MPC活性低，而多数NSCLC细胞系（包括KRAS突变型A549和H460）MPC活性显著升高。通过筛选内部化合物库，鉴定出化合物NLM1。在1.0 μmol/L浓度下，NLM1在H460、A549、H292、PC9、HCC827、H3122和H2228等NSCLC细胞系中显著诱导空泡化，而对正常细胞系影响极小。NLM1以时间和剂量依赖方式触发空泡化，0.2 μmol/L即显现效果，且对NSCLC细胞系IC₅₀值低于2.0 μmol/L，对正常细胞系IC₅₀≥10.0 μmol/L，显示出良好的选择性。集落形成实验证实NLM1剂量依赖性地抑制H460和A549细胞增殖，效果优于已报道的甲硫亡诱导剂12A。Western blot和Annexin V/FITC染色表明NLM1不诱导凋亡，caspase抑制剂Z-VAD-FMK、坏死性凋亡抑制剂Necrostatin-1、自噬抑制剂3-MA和ER应激抑制剂4-PBA均不能挽救NLM1诱导的空泡化和细胞死亡，证明其独立于凋亡、坏死性凋亡、自噬和ER应激。NLM1诱导的空泡化可被氯喹（chloroquine，CQ）和MPC抑制剂EIPA显著减弱，FITC-dextran摄取实验证实空泡与FITC斑点共定位，TEM显示空泡为单层膜囊泡且无线粒体或ER肿胀。空泡呈现晚期内体特征（Rab7和LAMP1上调并共定位），lucifer yellow可进入空泡而mito-tracker、ER-tracker和lyso-tracker不能，证实空泡源自晚期内体。Seahorse分析显示NLM1抑制线粒体氧化磷酸化和糖酵解。这些结果共同确立了NLM1作为高效甲硫亡诱导剂的地位。

3.2 NLM1是以独特结合模式靶向Nur77的拮抗剂

Kaplan–Meier生存分析证实Nur77高表达的肺癌患者生存期显著较差。SPR分析显示NLM1与Nur77-LBD强结合（K_D = 0.079 μmol/L），且对RXRα、ERα、ERβ、PPARα和PPARγ等其他核受体具有高选择性。荧光淬灭实验进一步支持其结合亲和力。报告基因实验表明NLM1剂量依赖性地抑制Nur77介导的转录激活，而不影响RXRα或RARγ，证明NLM1是选择性Nur77拮抗剂。研究人员解析了NLM1/Nur77-LBD复合物晶体结构（2.18 ?，PDB ID：8Z5A），发现NLM1与B位点残基（HIS372、Arg450、Arg454、LYS456、His494和GLY458）形成关键接触。与已知配体TMPA、NB1和NF1相比，NLM1采用独特结合姿态：吗啉环与His494和Gly458形成氢键，酰胺羰基与Lys456形成氢键，噻唑基插入深疏水口袋并与His372形成π–π堆积、与Arg450和Arg454形成π–阳离子相互作用。三重B位点突变体（H372A_K456R_G458W）使NLM1结合亲和力降低约10倍，证实NLM1占据Nur77-LBD的B位点。

3.3 NLM1以Nur77依赖方式诱导甲硫亡

siRNA敲低实验显示，NLM1诱导的细胞质空泡化在HeLa-siNur77和A549-siNur77细胞中显著减弱，且这些细胞对NLM1的敏感性降低（IC₅₀值显著升高）。点突变互补实验表明，野生型Nur77、S351A和Nur77-2G可恢复NLM1诱导的细胞抑制和空泡化，而H372A或K456A突变体不能。这些结果证实NLM1结合Nur77-LBD B位点对甲硫亡诱导至关重要。

3.4 NLM1通过Nur77–LYSET轴触发甲硫亡

RNA-Seq分析鉴定出1923个差异表达基因，KEGG分析显示NLM1处理主要影响溶酶体通路相关基因（31个基因，FDR = 2.08e-07），GSEA证实溶酶体基因签名显著下调。RFP-GFP-LC3串联报告实验显示NLM1处理后自噬溶酶体（RFP-only斑点）数量和大小显著增加，提示自噬体–溶酶体融合仍发生但后续降解步骤受损。Western blot显示NLM1降低组织蛋白酶L（CTSL）、组织蛋白酶D（CTSD）和己糖胺酶Aα（HEXα）蛋白水平，且对成熟（活性）形式的降低更为显著。LYSET敲低消除了CTSD成熟形式，而NLM1以时间和剂量依赖方式降低LYSET蛋白水平。Nur77缺陷降低LYSET和成熟CTSL蛋白水平，NLM1处理进一步增强Nur77、LYSET和成熟CTSL的降低，且Nur77敲低和NLM1处理均下调LYSET mRNA表达，表明Nur77调控LYSET表达，NLM1在转录和蛋白水平抑制LYSET表达。核–质分离和免疫荧光分析显示NLM1促进Nur77从细胞核向细胞质输出，CDIM8（Nur77核输出特异性抑制剂）恢复NLM1损害的成熟CTSL水平，CDIM8和leptomycin B（LMB）均显著抑制NLM1诱导的空泡化和细胞死亡，证明Nur77的细胞质定位对甲硫亡诱导至关重要。共聚焦显微镜显示NLM1处理后Nur77与溶酶体标志物LAMP2共定位，GFP-Nur77和3×HA-LYSET共转染实验证实Nur77与LYSET在溶酶体共定位。co-IP实验证实NLM1增强Nur77与LYSET的相互作用。突变分析鉴定出Nur77的AF2结构域和LYSET的LKAQLL基序是Nur77–LYSET蛋白相互作用的关键结构元件。

四、讨论与结论

该研究首次报道了靶向Nur77/LYSET轴的首创新型甲硫亡诱导剂NLM1。NLM1通过特异性结合Nur77-LBD B位点，促进Nur77核输出至细胞质并与LYSET在溶酶体相互作用，抑制LYSET表达，减少溶酶体水解酶（CTSL、CTSD、HEXα），阻断巨胞饮体降解，从而触发甲硫亡。NLM1在顺铂敏感和顺铂耐药的NSCLC异种移植瘤模型中均表现出显著抗肿瘤疗效，且具有可接受的药代动力学特征和安全性。该研究确立了Nur77作为甲硫亡治疗的新靶点，阐明了Nur77/LYSET轴在将MPC从促生存切换为促死亡中的机制，为NSCLC（无论是否具有顺铂耐药）提供了开创性的治疗候选药物。该论文发表于《Acta Pharmaceutica Sinica B》。