《Acta Pharmaceutica Sinica B》：Structural insights into orthosteric and allosteric inhibition of non-canonical oncogenic PI3K
α mutants
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阻断致癌PI3Kα信号转导是针对PIK3CA突变相关实体瘤的已验证治疗策略。然而，热点突变之外的致病机制仍知之甚少。本研究结合冷冻电子显微镜（cryo-EM）、生物化学分析和分子动力学（MD）模拟，研究了非经典R88Q和R348*突变及其受正构和变构抑制剂调控
阻断致癌PI3Kα信号转导是针对PIK3CA突变相关实体瘤的已验证治疗策略。然而，热点突变之外的致病机制仍知之甚少。本研究结合冷冻电子显微镜（cryo-EM）、生物化学分析和分子动力学（MD）模拟，研究了非经典R88Q和R348*突变及其受正构和变构抑制剂调控的机制。冷冻电镜分析揭示，R88Q通过变构方式破坏ABD–激酶偶联，增加ABD动力学，并在不消除nSH2结合的情况下解除p85α介导的自身抑制。分子动力学模拟进一步表明，R348*截断显著 destabilizes p85α–p110α界面，促进亚基间分离和极端柔性。CYH33占据正构ATP结合口袋，直接阻断催化活性；在R88Q背景下，它还额外约束高动态的ABD，部分恢复自身抑制。RLY-2608和STX-478变构结合由催化环和激活环形成的隐蔽口袋，从而增强p110α–iSH2界面，并促进ABD的长程构象有序化。这些发现扩展了PI3Kα致癌激活的图谱，并确立了正构（CYH33）和变构（RLY-2608、STX-478）配体以两种机制上不同的方式强化抑制性构象，从而对抗致癌PI3Kα突变体。
论文解读：非经典PI3Kα突变体的正构与变构抑制机制
磷脂酰肌醇3-激酶α（PI3Kα）在细胞增殖、存活和代谢稳态中发挥关键作用，其过度激活常由PIK3CA（编码催化亚基p110α）和PIK3R1（编码调节亚基p85α）的功能获得性突变驱动，是多种人类癌症的核心致病事件。已充分研究的经典热点突变（如螺旋域的E542K/E545K和激酶域的H1047R）通过增强酶活性、过度激活PI3K/AKT/mTOR通路而促进肿瘤进展。然而，除这些热点突变外，位于p110α适配器结合域（ABD）的非经典R88Q突变和p85α的R348*截短突变在临床上反复出现，但其致病机制和药物调控的结构基础长期不清楚。CYH33是一种选择性PI3Kα正构抑制剂（IC50=5.9 nmol/L），已在多种PIK3CA突变肿瘤中显示疗效，并于2026年获批用于特定卵巢透明细胞癌；而RLY-2608和STX-478是处于临床评估阶段的下一代突变选择性变构抑制剂，对野生型酶具有更好的选择性。尽管这些抑制剂在热点突变背景下有效，但它们如何对抗R88Q和R348*等非经典突变的结构机制仍属空白。为此，研究人员开展了本项研究，旨在从原子水平阐明R88Q和R348*的致病机制，以及正构和变构抑制剂对这些突变体的调控方式。
研究人员利用冷冻电子显微镜（cryo-EM）技术，解析了六种高分辨率PI3Kα复合物结构，包括未结合配体的野生型（WT）PI3Kα、未结合配体的R88Q突变体、CYH33结合的WT、CYH33结合的R88Q、STX-478结合的R88Q以及RLY-2608结合的R88Q，全局分辨率分别为2.75、2.72、2.96、2.65、2.82和2.73 ?。同时，研究人员辅以分子动力学（MD）模拟和体外激酶活性实验，系统分析了突变的构象后果和抑制剂的结合模式。其中，R88Q蛋白在HighFive昆虫细胞中共表达全长野生型p110α与p85α，并引入R88Q点突变；R348*截短体（p85α残基M1–L347）因复合物高度不稳定而未能获得适用于冷冻电镜分析的均一样品，因此主要借助MD模拟和生化实验进行表征。在动力学模拟中，研究人员分别构建了WT、R88Q和R348*背景的未结合或抑制剂结合体系，采用CHARMM36m力场，在0.15 mol/L NaCl和显式TIP3P水分子条件下进行1–2 μs的NPT系综模拟，并计算了均方根偏差、均方根波动、回转半径、界面埋藏面积和配体-口袋最小距离等参数。
3.1 总体结构。研究人员通过冷冻电镜获得了六个复合物的高质量密度图，所有模型均包含p110α全部结构域和p85α的nSH2结构域，以及结合的配体。在未结合配体的R88Q结构中，p85α部分脱离p110α：仅nSH2清晰可辨，而p110α的ABD和p85α的iSH2区域密度差，提示高度构象柔性；尽管p110α与p85α仍保持二聚体状态，但R88Q突变诱导了膜结合环1、环2、激活环和kα11等区域的局部构象重排。相比之下，CYH33结合后增强了ABD的稳定性，并改善了iSH2密度，使其可以被完整建模；RLY-2608和STX-478结合在由催化环和激活环界定的隐蔽变构口袋中，与ATP结合位点远隔，并赋予ABD和iSH2长程稳定化。
3.2 未结合配体的R88Q结构。在R88Q突变体中，R88位于ABD–激酶界面，该区域在WT中富含负电荷残基（E738、D743、D746），并与R88形成广泛的盐桥网络。R88Q突变消除了这些电荷-电荷相互作用，使ABD高度柔性并破坏ABD与iSH2之间的相互作用，导致iSH2结合界面解体；但nSH2与螺旋域之间的关键氢键（如E542/E545与nSH2的R358/L380）得以保留。这一发现支持R88Q独特的过度激活机制：p85α介导的自身抑制显著减弱，但nSH2仍结合在C2和螺旋域上，形成了“松弛但未完全解离”的抑制性架构。
3.3 CYH33结合的野生型PI3Kα。CYH33在正构ATP结合口袋中呈现特征性的“Y”型构象，其吗啉氧与V851主链酰胺形成氢键，CF3基团靠近P-loop，而氨基甲酸酯和吡啶基团伸向ATP位点的磷酸尾部亚口袋，与K802和D810形成氢键，4-(甲基磺酰基)哌嗪基则伸向由R770、M772、S773和W780围成的溶剂暴露区。这些相互作用诱导P-loop相对于BYL-719结合结构发生明显重排，并与CYH33对PI3Kα的强结合亲和力一致。
3.4 CYH33对R88Q的正构抑制。CYH33结合R88Q的总体模式与WT高度相似（Cα RMSD=0.56 ?），且形成了两个WT中未见到的独特氢键：哌嗪基与Q859、氨基甲酸酯氧与K802的旋转异构体。MD模拟表明，CYH33的结合使R88Q中原本无序的ABD和iSH2变得有序，p110α–p85α界面埋藏面积维持在约6530 ?2，与未结合配体的WT相当，表明CYH33实质性地恢复了p85α–p110α界面；但ABD N-末端残基7–17仍保持高度动态，提示R88Q突变固有的柔性并未被完全抑制。
3.5 RLY-2608对R88Q的变构抑制。体外激酶实验显示，RLY-2608对R88Q和H1047R的IC50分别为6.4和3.2 nmol/L。冷冻电镜结构揭示RLY-2608占据一个由催化环、激活环、kα9和kα10形成的隐蔽变构口袋，与正构ATP口袋完全分离。该结合模式与先前报道的WT、H1047R、E542K和E545K结构高度保守，仅局部差异。RLY-2608的结合重塑了激活环并使其有序化，通过iSH2卷曲螺旋向ABD传播稳定信号，增强C2–iSH2和iSH2–ABD之间的氢键网络，从而将R88Q驱动到抑制性构象。
3.6 STX-478对R88Q的变构抑制。STX-478同样结合RLY-2608所占据的变构口袋，但其更线性的骨架导致与RLY-2608不同的结合模式（IC50对R88Q为6.0 nmol/L，对H1047R为7.0 nmol/L）。STX-478结合使ABD得到良好解析，但iSH2 N-末端（残基573–598）和部分激活环仍无法建模，表明其对自身抑制装配的稳定程度不如RLY-2608完全。结构-功能分析显示，催化/激活环区域的突变（Y947A、K942E、D915A）对两种变构抑制剂均产生强烈的敏感性降低，而C2域的N345A突变几乎完全取消RLY-2608的抑制效力（无法在测试浓度范围内获得完整量效曲线），但STX-478仍可被定量抑制（IC50=198.4 nmol/L）；P-loop的S773A对STX-478的效力降低3.12倍，而对RLY-2608几乎无影响（1.14倍）。3D变异性分析（3DVA）和MD模拟进一步表明，STX-478允许更宽广的ABD–iSH2构象排列，而RLY-2608将调节模块限制在更窄的构象空间中，提示两种变构抑制剂通过不同的变构偶联强度实现抑制。
3.7 R348*的柔性。R348*无义突变在p85α的nSH2区域上游引入提前终止密码子，截短了iSH2和nSH2域，消除了p85α对p110α的主要调节接触。该突变体在纯化中表现为低溶解度、高聚集倾向，两种独立纯化策略均未能获得适用于冷冻电镜的均一样品，反映出其内在不稳定性。功能实验显示，正构抑制剂CYH33对R348*保持高效（IC50=2.8 nmol/L），而变构抑制剂RLY-2608和STX-478的效力相对降低（IC50分别为10.9和18.7 nmol/L，而它们对R88Q为6.4和6.0 nmol/L，对H1047R为3.2和7.0 nmol/L）。微秒级MD模拟表明，R348*截短即使在抑制剂结合下也导致p110α–p85α界面进行性分离，ABD–p85α界面埋藏面积趋近于零，两亚基间距离随模拟时间增加而增大；这种界面丧失解释了该突变体的组成性活性和变构抑制剂效力下降的机制，因为RLY-2608和STX-478的抑制作用依赖于完整的p110α–iSH2界面传播信号。
讨论与结论部分指出，R88Q和R348*分别代表两种新的激活范式：R88Q通过解除ABD–激酶偶联造成“松弛但未断裂”的自身抑制衰竭，而R348*通过截断调节亚基彻底破坏p85α–p110α调节界面。正构抑制剂CYH33虽占据ATP位点，却能意外地恢复远端的自身抑制界面；变构抑制剂RLY-2608和STX-478则通过重塑激活环和加强p110α–iSH2界面来传导抑制信号。值得注意的是，STX-478与RLY-2608虽然结合同一口袋，却展现出不同的调节域有序化程度和变构偶联强度，表明同一隐蔽口袋可被机制上不同的变构稳定途径所利用。此外，R348*对变构抑制的敏感性降低设定了变构抑制的边界条件，而正构抑制剂因其不依赖调节亚基的机制而依旧有效。这些发现支持对PI3Kα突变驱动的癌症进行超越经典热点的分子分层，并强调正构与变构化学型应作为突变感知治疗组合中的互补工具，而非可互换选项。
