基于运动性定量分析的肝片吸虫幼体阶段化合物活性半自动化筛选新方法

《PLOS Pathogens》：A new semi-automated, motility-based screening assay for discovery of compounds with activity against the juvenile stage of Fasciola hepatica

　　

肝片吸虫（Fasciola hepatica）是一种吸虫类寄生虫，可引起影响全球人类和家畜肝脏的片形吸虫病。与其他食源性吸虫感染一样，片形吸虫病被归类为一种被忽视的热带病。此外，由于反刍动物感染，该病还造成巨大的农业经济损失。目前尚无可用疫苗，疾病控制严重依赖药物治疗，尤其是三氯苯达唑（TCBZ）。然而，过去四十年间TCBZ的密集使用导致治疗失败率上升和耐药性寄生虫的出现。因此，寻找新的治疗方案成为当务之急。然而，现有的药物筛选工具十分有限。为应对这一需求，研究人员建立了一种新型、半自动化、标准化且客观的筛选方法，该方法基于显微活体成像技术监测新孵育幼虫的运动性。该方法的验证采用了一组十种已知驱虫特性的化合物，其中包括TCBZ（半数抑制浓度IC50：1.5 μM）和新型肝片吸虫瞬时受体电位美拉司他丁（TRPMPZQ）离子通道激活剂苯甲酰胺喹唑啉酮（IC50：1.05 μM）。除了这两种已知对肝片吸虫具有活性的化合物外，还有三种化合物因其快速起效和纳摩尔级的IC50值而被认为特别具有前景：水杨酰苯胺类化合物MMV665807（IC50：44 nM）、氯硝柳胺（IC50：32 nM）及其乙醇胺盐——氯硝柳胺乙醇胺盐（IC50：9 nM）。补充的活/死染色实验显示，只有TCBZ表现出杀寄生虫活性，而其他化合物虽然导致寄生虫麻痹，但在72小时内并未致死。对药物处理过的寄生虫进行扫描电子显微镜观察发现，在对应IC50浓度下未观察到显著损伤，但在20 μM浓度下可见明显表型变化。本研究提出的运动性检测方法为发现新型驱虫化合物提供了可靠手段，并有助于推动对抗片形吸虫病的持续努力。

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研究背景与目的

片形吸虫病是由肝片吸虫（Fasciola hepatica）引起的一种人兽共患肝脏寄生虫病，被世界卫生组织列为被忽视的热带病。该病不仅对人类健康构成威胁，更在全球范围内对畜牧业造成巨大经济损失，例如在欧洲每年导致的农业损失估计高达6.35亿欧元。目前尚无有效的疫苗，疾病防控高度依赖药物治疗，其中三氯苯达唑（TCBZ）是唯一获批用于人类且同时对成虫和幼虫阶段均有效的药物。然而，经过四十多年的广泛使用，TCBZ耐药性问题日益严峻，已在澳大利亚、欧洲多国和南美洲的家畜中报道，并在秘鲁、埃及和葡萄牙的人类患者中也出现了治疗失败的案例。例如，在秘鲁的一项研究中，尽管儿童接受了多轮高剂量治疗，仍有10%未能治愈。与此同时，现有可用的抗片形吸虫药物种类极其有限，且许多仅对成虫有效。因此，迫切需要开发新的治疗药物。然而，针对肝片吸虫的药物筛选工具非常有限，传统的基于形态学或人工评分的方法主观性强、通量低。为了解决这一瓶颈，研究人员旨在建立一种客观、标准化、可扩展的半自动化筛选方法，利用肝片吸虫新孵育幼虫（NEJ）的高度运动性作为指标，来高通量地鉴定具有生物活性的化合物。

关键技术方法概述

为了实现对NEJ运动性的客观量化，研究人员开发了一套结合显微活体成像与图像处理的半自动化分析方法。具体流程包括：将经体外脱囊获得的NEJ分置于384孔板中培养；使用配备加热装置的倒置显微镜在固定时间点（如24、48、72小时）对每个孔拍摄一系列延时图像（最终方案为每10秒拍摄一张，共4张）；利用ImageJ软件对图像序列进行处理，通过逐帧减去像素强度来量化因寄生虫移动而产生的像素变化面积（Δ像素），从而得到原始运动性数据；将该数值除以每孔的寄生虫数量，得到“平均每条NEJ的运动性”，再通过与无药对照组比较，计算相对运动百分比，以此评估化合物的抑制效果。此外，研究还采用了荧光素二乙酸酯（FDA）/碘化丙啶（PI）双染法区分活虫与死虫，并使用扫描电子显微镜（SEM）观察药物处理后的寄生虫超微结构变化。

研究结果

1. 用于量化肝片吸虫NEJ运动的检测方法优化

研究人员首先优化了成像参数。通过比较5、10、20、30和50秒的拍摄间隔，发现不同间隔下的平均每条NEJ运动性无显著差异，表明5秒或10秒的间隔足以捕捉运动信息。考虑到检测灵敏度，最终选择10秒间隔。随后，通过比较含1至10条NEJ的孔，发现当每孔寄生虫数达到3条以上时，运动性数据的标准差开始减小，变异降低。为确保读数的稳健性和一致性，研究人员确定每孔至少需要5条NEJ。

2. DMSO和孵育时间对寄生虫运动性的影响

为排除溶剂和培养条件的影响，研究人员检测了培养基和0.4% DMSO对NEJ运动性的影响。结果显示，在24、48和72小时的时间点上，寄生虫的运动性随时间显著增加，但DMSO组与无药对照组在同一时间点的运动性无显著差异，证明0.4% DMSO对NEJ运动性无不良影响。同时，通过对TCBZ的时间-剂量效应分析，发现较高浓度的TCBZ在6小时内即可几乎完全抑制运动，而在较低浓度（如3.5 μM）下，需要72小时的孵育才能完全消除运动性。这表明72小时的孵育时间是必要的，可以最大限度地提高检测灵敏度，避免漏掉起效较慢的化合物。

3. 使用一组驱虫化合物验证运动性检测方法

研究人员应用该检测方法对十种已知驱虫活性的化合物进行了评估。结果表明，苯并咪唑类药物（阿苯达唑、甲苯达唑、芬苯达唑）和吡喹酮即使在40 μM的高浓度下，72小时后也未显著抑制NEJ运动性，这与已知的阿苯达唑对未成熟肝片吸虫活性较差以及肝片吸虫对吡喹酮天然不敏感的特性相符。相比之下，苯甲酰胺喹唑啉酮（BZQ）在10 μM和40 μM浓度下均能迅速将NEJ运动性降至接近零（约6-8%），显示出强效抑制作用。布帕伐醌也表现出活性，但起效较慢，72小时后仍残留少量运动。最为突出的是，氯硝柳胺、氯硝柳胺乙醇胺盐（NEN）和MMV665807这三种水杨酰苯胺类化合物，以及阳性对照TCBZ，均在24小时内完全消除了NEJ的运动性（运动性为0%）。

4. 药物处理后NEJ的存活率

为了区分运动抑制是源于麻痹还是死亡，研究人员在72小时终点进行了FDA/PI活死染色。结果显示，在所有测试化合物中，只有TCBZ在40 μM浓度下杀死了所有寄生虫，在10 μM浓度下也导致了大部分寄生虫死亡。而其他所有活性化合物（包括BZQ、氯硝柳胺、NEN和MMV665807），尽管完全抑制了运动性，但在72小时内并未导致大多数寄生虫死亡，它们主要表现为麻痹而非杀灭作用。

5. 活性化合物的效力及药物诱导的寄生虫形态改变

研究人员进一步测定了五种活性化合物的剂量-反应曲线。结果显示，NEN的效力最高，IC₅₀仅为9 nM；其次是氯硝柳胺（32 nM）和MMV665807（44 nM）；BZQ的IC₅₀为1.05 μM；而唯一具有杀灭作用的TCBZ的IC₅₀最高，为1.5 μM。SEM观察发现，在IC₅₀浓度下，这些化合物均未引起明显的形态损伤。但在20 μM高浓度下，NEN和MMV665807处理的寄生虫表面皱缩塌陷，而BZQ处理的寄生虫则失去细长形状，变为圆形。值得注意的是，在光镜下观察到氯硝柳胺、NEN和MMV665807处理的寄生虫出现肿胀现象，这与其作为氧化磷酸化解偶联剂、导致渗透压失衡的作用机制一致。

讨论与结论

本研究成功建立了一种基于运动性量化的、可用于肝片吸虫NEJ阶段的半自动化药物筛选方法。该方法具有客观、标准化、可扩展的优点，能够在384孔板上进行操作，提高了通量。其局限性在于手动分装寄生虫耗时，且需要足量的囊蚴供应。72小时的孵育时间虽然增加了检测灵敏度，但也可能漏掉需要宿主代谢激活或作用于干细胞而不直接影响短期运动性的化合物。尽管如此，该方法仍是目前少数可用于大规模筛选NEJ阶段活性化合物的实用工具之一。

通过对一组化合物的验证，研究证实了该方法的可靠性。苯并咪唑类药物对NEJ无效，符合其临床主要用于成虫的特点；吡喹酮无效，印证了肝片吸虫TRPM_PZQ通道的突变导致耐药；BZQ对NEJ同样有效，扩展了其已知的对未成熟和成虫的活性范围。最重要的发现是，三种水杨酰苯胺类化合物——氯硝柳胺、NEN和MMV665807——展现出极强的抗NEJ活性，其IC₅₀值低至纳摩尔级别，且起效迅速。尽管它们主要是麻痹而非杀死寄生虫，但其强大的效力值得关注。研究人员指出，虽然氯硝柳胺在人体内的半衰期较短，但其衍生物或类似物可能具有更好的药代动力学特性。此外，未来还需要在成虫阶段验证这些化合物的活性，并进行哺乳动物细胞毒性测试和体内动物模型实验，以全面评估其作为候选药物的潜力。

研究结论：这项工作为筛选作用于肝片吸虫NEJ的化合物提供了一种可靠的方法，并揭示了三种水杨酰苯胺类化合物（氯硝柳胺、NEN和MMV665807）此前未被充分认识的、对该寄生虫阶段的强效活性。