使用基于4-氨基苯基苯并噻唑的螯合剂靶向Cu2+介导的Aβ聚集和ROS生成

《Inorganica Chimica Acta》：Targeting Cu2+ mediated Aβ aggregation and ROS generation using 4-aminophenylbenzothiazole–based chelators

　　**摘要**阿尔茨海默病（AD）是一种多因素神经退行性疾病，极难治愈，影响全球数百万人。与淀粉样斑块相关的过量铜离子被认为通过Fenton型反应产生活性氧（ROS），在AD病理中起重要作用。铜离子通过影响Aβ聚集以及稳定某些有毒的小寡聚体物种来促进毒性。因此，使用小螯合分子从淀粉样聚集体中螯合铜离子已成为一种显著的治疗策略。本文报道了四种使用2-(4-氨基苯基)苯并噻唑支架设计的小金属离子螯合分子（L1–L4），这些分子被选择用于淀粉样蛋白识别，并已合成和表征。它们的铜配合物也被分离并进行详细表征，包括晶体学分析，揭示了Cu(L)?物种的形成。确定了螯合剂的酸度常数（pK_a），其中L1由于存在两个叔丁基而酸性最弱。从Aβ–Cu复合物中螯合Cu²⁺的竞争性实验表明形成了三元复合物，而非L1–L4完全螯合Cu²⁺。延长Aβ聚集研究表明，所有四种螯合剂均抑制聚集，而不仅仅是延迟聚集。ThT荧光竞争性结合测定得出了较低的K_i值，表明与Aβ纤维具有很强的结合亲和力。此外，抗坏血酸消耗实验表明，这些螯合剂抑制了铜介导的ROS产生，其中L3和L4显示出最高的活性。总体而言，这些分子显示出减轻AD中铜介导的病理过程的潜力。**引言**阿尔茨海默病（AD）仍然是全球最普遍且最具破坏性的神经认知障碍疾病，预计未来仍将如此[1], [2]。AD随年龄增长而进展，具有多因素和异质性病因，至今仍未完全阐明，自1980年代中期Glenner和Masters从扭曲的β-折叠纤维中分离出淀粉样-β肽以来，一直受到深入研究[3], [4]。Hardy和Higgins假设这些淀粉样-β蛋白（AβP）的沉积是主要的致病因素，伴有神经纤维缠结、细胞丢失、血管损伤，随后是痴呆，与这种沉积相关[5]。这一假设得到了多项研究的支持，同时也面临批评[6], [7], [8]，特别是在Lambert等人表征了小的可扩散Aβ寡聚体并发现它们以纳摩尔浓度存在于中枢神经系统（CNS）中可以杀死成熟神经元之后[9]。2000年末，Bush等人提出，新皮质中Zn²⁺和Cu²⁺浓度升高使pH从7.4降至6.8，诱导Aβ聚集并负责局部脑损伤[10], [11]。他们指出，在螯合剂或碱化的存在下，这种反应是完全可逆的[11], [12]。这一观察之后，过渡金属离子在AD病理中的作用获得了越来越多的支持和验证[13], [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22]。越来越多的证据表明，Aβ淀粉样斑块产生了氧化应激环境[23], [24]。Bush等人展示了金属-Aβ相互作用的一个额外方面，证明人类Aβ在Fe³⁺和Cu²⁺存在下通过Fenton型反应直接产生过氧化氢，并且这种机制涉及金属离子的还原[25], [26]。Dey等人的研究结果表明，颞叶脑中血红素的显著增加会加剧AD，因为它与Aβ肽结合形成血红素-Aβ复合物。此外，这种血红素也可以与Cu-Aβ结合形成血红素-Cu-Aβ复合物，这进一步产生还原性氧物种，可能对AD最具毒性[27], [28], [29]。Faller和Hureau等人为阐明AD中过渡金属离子介导的氧化应激机制做出了重大贡献[30], [31], [32], [33], [34]。文献清楚地表明，金属离子特别是铜在AD的主要病理机制中起着中心和不可或缺的作用。它驱动了Aβ聚集和ROS产生，坚定地确立了铜螯合疗法作为AD的一种高度合理且有说服力的治疗方法[22], [35], [36]。近年来，能够高效螯合金属离子、解离Aβ–金属复合物并破坏ROS循环的金属特异性螯合剂引起了极大关注。早期的常规简单金属螯合剂，如地拉氧胺（DFO）[37]、氯膦嗪（CQ）[38], [39]、8-羟基喹啉（8-HQ）[40], [41]，主要研究用于金属螯合。然而，它们在调节淀粉样蛋白物种或解决AD的其他病理原因方面无效。AD的多因素性质要求开发能够同时调节多个病理途径的治疗药物。因此，已合理设计和评估了多种多功能分子。这些药物使用混合分子方法开发，其中两种针对不同病理机制的不同药效团被组合到一个支架中[42], [43], [44]。在这些策略中，淀粉样蛋白识别框架如硫黄素-T（ThT）及其衍生物，如PIB、刚果红和白藜芦醇，已成功与包括DFO、CQ、salen、三氮杂环壬烷（TACN）、环己烷等金属螯合部分结合，从而实现对淀粉样蛋白聚集和金属失调的同时靶向[45], [46], [47], [48], [49], [50], [51]。我们小组开发了受硫黄素-T和刚果红支架启发开发的多功能分子，这些分子表现出强烈的淀粉样蛋白结合、有效的Aβ调节、金属螯合、抑制金属–Aβ介导的ROS产生和乙酰胆碱酯酶（AChE）抑制，突出了它们在治疗应用中的潜力[52], [53], [54], [55]。基于我们的分子设计原则和先前的发现，本文报道了四种多功能螯合分子的开发，这些分子使用混合策略构建，将已知的与Aβ纤维相互作用的2-(4-氨基苯基)苯并噻唑框架与紧凑的金属螯合部分即取代的邻羟基苯甲醛相结合。这些螯合剂通过简单的单步方案合成并进行了彻底表征。分离了它们相应的Cu²⁺配合物以确定配体–金属化学计量比，并进行了广泛的表征。为了评估它们的抗AD潜力，使用多种光谱技术在有Aβ和无Aβ存在下系统地研究了Cu²⁺的螯合。此外，研究了它们抑制Aβ聚集和Aβ结合亲和力的能力。使用抗坏血酸消耗实验评估了这些分子减轻铜介导的ROS产生的功效。总体而言，结果表明它们具有同时减轻铜介导的原因，如Aβ聚集和ROS产生的潜力。**材料与一般方法**3,5-二叔丁基-2-羟基苯甲醛（Sigma-Aldrich）、3-叔丁基-2-羟基苯甲醛（Sigma-Aldrich）、5-叔丁基-2-羟基苯甲醛（Sigma-Aldrich）、邻香草醛（Avra）、硫黄素-T（Sigma-Aldrich）、CDCl₃（Sigma-Aldrich）、醋酸铜（CDH）、2-氨基硫醇（CDH）、冰醋酸（CDH）、去离子水（CDH）、4-氨基苯甲酸（Avra）和多聚磷酸（Avra）分别购自相应的单位，未经进一步纯化即直接使用。磷酸缓冲液**螯合剂L1–L4的设计原理**这些分子的设计受需要同时解决AD中涉及的多个病理途径的驱动。鉴于AD的多因素性质，采用了混合分子策略，将淀粉样蛋白结合基团与金属螯合臂整合到单个支架中（图1）。为了实现这一点，选择了4-氨基苯基苯并噻唑框架作为淀粉样蛋白识别框架[39], [56]。这个核心被合理地与取代的...**结论**合成的螯合剂分子（L1–L4）已系统地评估了具有AD治疗相关性的因素。所有螯合剂均通过单步缩合方案合成并进行了表征，包括它们的溶液态物种鉴定。它们相应的Cu²⁺配合物被分离，并使用各种无机光谱技术进行了全面分析。用于确定酸度常数的电位滴定法揭示，这些螯合剂主要...**CRediT作者贡献声明**Priyal Malpani：撰写 – 原稿，方法，调查，形式分析，数据管理。Surabhi Bhatt：调查，数据管理。Aishwarya Mehta：数据管理。Nattamai Bhuvanesh：形式分析，数据管理。Hemant Joshi：形式分析。Anuj K. Sharma：撰写 – 审阅与编辑，验证，监督，资源，项目管理，方法，调查，资金获取，概念化。**利益冲突声明**作者声明，他们没有已知的竞争经济利益或个人关系可能会影响本文报道的工作。**致谢**A. K. S. 感谢科学与工程研究理事会（SERB）的财政支持（参考编号：CRG/2022/004355）。AKS感谢教育部（MoE）的资助（参考编号：MoE/STARS/2023-0529）。PM感谢印度标准与调查委员会（CSIR）颁发的CSIR直接SRF奖项（09/1131(23161)/2025-EMR-I）。作者感谢中央拉贾斯坦大学化学系的研究设施，由DST-FIST（参考编号：SR/FST/CSI-257/2014(C)）和中央大学CIF提供...Priyal Malpani | Surabhi Bhatt | Aishwarya Mehta | Nattamai Bhuvanesh | Hemant Joshi | Anuj K. Sharma印度，阿杰默，邦达斯因德里，中央拉贾斯坦大学化学系，305817