多千赫兹光学微弹性成像技术在软生物材料粘弹性表征中的应用——以黑色素瘤球体为例

《Journal of Biomedical Optics》：Multikilohertz optical microelastography for viscoelastic characterization of soft biomaterials demonstrated on melanoma spheroids

　　

图1 压电驱动器产生的激发信号表征（Hann窗调频信号，15至30 kHz）。上：由激光多普勒测振仪测量并由示波器记录的时域信号。下：信号的傅里叶变换，显示其频率成分与输入调频激发高度吻合。

1. 引言

细胞环境的粘弹性特征日益被视为肿瘤生长、侵袭和治疗反应的重要因素1–4。机械微环境通过力学转导过程调控细胞命运、组织功能和疾病进展5。与正常组织相比，恶性组织通常表现出较高的整体刚度6，而单个癌细胞则可能比其正常对应细胞更具柔顺性7。在多细胞尺度（数十至数百微米）上，力学性质与细胞群体行为和组织机构直接相关8,9。

为表征微观尺度的粘弹性特征，剪切波弹性成像提供了一种非侵入性方法，其中波速反映弹性响应，波的衰减反映粘性耗散。要实现与多细胞结构相当的波长，通常需要多千赫兹频率。宽带信号尤为理想，因为软组织表现出强烈的频率依赖性，通过色散分析对其进行表征效果最佳10。然而，两个基本限制制约了当前的实现。

第一，粘弹性介质中的剪切波衰减随频率急剧增大，限制了传播距离并降低了信噪比，使定量色散分析和粘性损耗估算变得复杂11。

第二，传统激发方法（如点源或线源）引入了几何扩展效应，即由于能量守恒导致的振幅衰减与传播距离成反比。该效应将几何衰减叠加在材料固有的耗散之上，从而混淆了对粘性损耗的估计。

这两个因素共同限制了近超声频段中定量弹性成像的发展。

现有技术在空间尺度和激发频率方面均体现了上述局限。磁共振弹性成像（MRE）的工作频率通常低于500 Hz12，产生的波长过大（毫米级），无法满足微观尺度的检测需求。传统基于超声的剪切波弹性成像（SWE）工作在较高频率，但其横向分辨率受声束宽度（数百微米）限制6。采用连续激发方法的变体，如谐波运动成像13,14、连续SWE15,16和振动SWE17，扩展了测量能力，但仍受到类似的空间分辨率和衰减限制。

在另一极端，原子力显微镜（AFM）可实现纳米级分辨率18，但本质上是一种逐点的基于表面的技术，主要探测准静态力学响应。布里渊显微镜通过非接触光散射在吉赫兹频率下工作，可实现亚细胞分辨率19，但不能直接提供剪切模量等体积粘弹性参数。

光学弹性成像的最新进展扩展了测量能力。光学相干弹性成像（OCE）提供了极高的时间采样率，探测器采集速率可达兆赫兹范围20。然而，需要区分探测器采集速率与机械激发频率。尽管检测速度可以非常高，但大多数OCE实现中所使用的机械激发频率仍局限于亚千赫兹和低千赫兹范围（通常为0.1至5 kHz）21。近期的表面波实现已将激发频率扩展至约10 kHz22。然而，与其他OCE研究类似，它们依赖局限于表面的波传播，而非通过体积结构进行的体积剪切波传播23。

因此，尽管光学检测灵敏度取得了显著进步24,25，但要同时实现体积剪切波传播、多千赫兹激发和亚毫米空间分辨率——即微观组织表征所需——仍然充满挑战。

肿瘤球体是实体肿瘤生物学中生理相关的三维模型26，鉴于其已知的机械异质性27以及机械信号与表型转化和治疗耐药性之间的已建立关联28,29，它们为微观粘弹性表征提供了理想系统。其力学性质已通过原子力显微镜18和微吸管吸吮30等接触方法进行了表征，近年来，基于准静态压缩的光学相干弹性成像——定量微观弹性成像及其高分辨率变体——也实现了肿瘤球体三维弹性的映射31,32。这些光学方法从准静态应变响应中提取有效弹性模量。与本工作最密切相关的是，光学微观弹性成像通过高速追踪机械诱导的剪切波恢复单个活细胞的弹性33，在单细胞尺度上结合了局部声源与噪声相关速度估计方法；而本文则采用准平面传播的剪切波和频率-波数分析，在肿瘤球体整体尺度上恢复Kelvin-Voigt参数（μ, η）。

在该尺度上，我们需要应对某些频率带宽限制。在低频端，目标几何尺寸设定了可用频带的下限。为了分辨球体而非周围介质的剪切力学特性，剪切波长λs = cs/f应与球体直径D相当或更小，通常为数百微米（即 f ? cs/D）；远大于球体的波长会使其有效处于亚波长状态，从而限制对其力学的分辨能力34。上限则由上述频率相关衰减设定，该衰减限制了传播距离和结构体内的可用带宽。

此外，这些结构体的结构异质性带来了进一步的困难：在千赫兹频率下，在此类高衰减且几何复杂的微环境中，将材料固有的耗散与几何伪影区分开来仍然困难35。

为应对这些挑战，我们修改并扩展了此前报道的光学微观弹性成像平台，该平台采用磁激发方式36，现引入压电准平面剪切波激发构型。所提出的系统结合了宽带调频激发（5至25 kHz）、高速成像（210,000 fps）和k空间色散分析，以估算频率相关的粘弹性参数。

该平台首先使用覆盖宽刚度范围（0.70至19.31 kPa）的聚丙烯酰胺仿体进行验证，随后应用于不同大小的黑色素瘤肿瘤球体，作为在具有生物学相关性的结构体中的概念验证。

2. 材料与方法

2.1 光学微观弹性成像平台

使用激光多普勒测振仪（OFV系列；Polytec GmbH，德国瓦尔德布龙）对驱动器产生的激发信号进行了表征，采用15至30 kHz的调频激发信号（图1）。驱动器峰值位移达到6.9 μm。

图1 压电驱动器产生的激发信号表征（Hann窗调频信号，15至30 kHz）。上：由激光多普勒测振仪测量并由示波器记录的时域信号。下：信号的傅里叶变换，显示其频率成分与输入调频激发高度吻合。

实验平台由用于产生剪切波的激发子系统和使用高速光学成像记录剪切波传播的成像子系统组成，两者均由计算机控制（图2）。

图2 光学微观弹性成像平台示意图。(a) 高速摄像机在记录样品图像序列的同时触发函数发生器。(b) 发生器输出宽带调频激发信号。(c) 两个串联的功率放大器将信号放大至150 V峰峰值。(d) 浸没在蒸馏水中并以不锈钢方块封盖的压电驱动器将电信号转换为垂直位移。(e) 耦合光纤束的卤素光源提供准直照明。(f) 记录的图像序列在Matlab中进行处理以提取样品位移。

激发信号由函数发生器（33500B系列；Keysight Technologies，美国加利福尼亚州圣罗莎）生成，并使用两个串联的功率放大器（型号7224；AE Techron Inc.，美国印第安纳州埃尔哈特）放大至150 V峰峰值，以适应压电驱动器的容性负载。

剪切波传播由配备可调变焦镜头的高速摄像机（FASTCAM SA-Z；Photron Ltd.，日本东京）以最高210,000 fps的速度记录，根据所需视场选择不同变焦镜头。透射照明由耦合准直光纤束的卤素光源（OSL2；Thorlabs Inc.，美国新泽西州牛顿）提供[图2(e)]。

压电驱动器安装在自定义水池底部，该水池侧壁光学透明，内部充满蒸馏水以提供透射光路。不锈钢方块刚性固定在驱动器上表面，样品固定在方块一侧。此构型可高效地将驱动器的垂直运动传递至样品，产生水平传播的剪切波[图2(d)]。

水浸式安装最大限度减少了光学畸变和折射伪影24,25。高速摄像机作为主触发源，同时启动图像采集和波形发射，从而确保第一帧记录图像与波激发的起始在时间上对齐[图2(a)和2(b)]。

2.2 实验方案

2.2.1 样品制备

为使用具有可调粘弹性特性的材料验证系统，制备了浓度为15%、17%、20%、23%和26%（v/v）的聚丙烯酰胺水凝胶。聚合反应通过过硫酸铵（APS；Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）引发，由N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED；Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）催化，丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液（19:1比例，40% w/v；Omnipur A9926，Merck Millipore，德国达姆施塔特）按照先前工作的优化配方制备36。

APS和TEMED含量分别调整为0.84%（w/v）和0.5%（v/v），以改善凝胶均匀性。为实现位移追踪，将空心硼硅酸盐玻璃微球（直径≤25 μm；产品编号S-HGB-015，LordsWorld Srls，意大利布雷西亚省德斯恩扎诺德尔加尔达）嵌入薄层中心层中，以提供明场透射。

对于概念验证生物学应用，按照标准的超低粘附方案，从MEL-1细胞系（BBSPA-Mel#1，西班牙安达卢西亚公共卫生系统生物库）培养黑色素瘤球体。细胞经离心沉淀后去除上清液，并将细胞重悬于新鲜培养基中。经台盼蓝活性评估（0.4%浓度）后，将约1000个活细胞接种至圆底超低粘附96孔板（最大体积200 μL）的每个孔中。接种24小时后进行部分换液（100 μL），球体组装通常在48小时内完成37。通过调整接种密度（每孔约1000至20,000个活细胞）获得不同大小的球体：上述约1000个细胞的方案产生了较小的球体（a、b；237至277 μm），而较高的接种密度则产生了较大的球体（c、d；660至823 μm）。

将完全形成的球体嵌入23%聚丙烯酰胺凝胶中以实现剪切波传播（图3）。选择该凝胶浓度是为了在机械支撑与高效波传输之间取得平衡。由于实验条件限制，无法将球体放置在靠近激发区域的位置，因此23%的配方提供了足够低的衰减，以确保在测量位置具有充足的剪切波能量。

图3 直径为277 μm的肿瘤球体嵌入23%聚丙烯酰胺凝胶中。球体距用于激发的不锈钢耦合块约400 μm（位置x = 0）。空间坐标参考100 μm标尺。

感兴趣区域（ROI）定义在每个球体的中心赤道带内，该区域局部曲率最小，波前可近似为局部平面。

所有测量均在环境温度（22至24°C）下进行；未施加主动温控。

2.2.2 数据采集方案

为优化光谱覆盖与信噪比之间的权衡，仿体和球体采用了不同的激发带宽。在仿体验证中，施加了三组调频信号（5至15 kHz、10至25 kHz和15至30 kHz），以评估宽频率范围内的粘弹性行为。

在球体表征中，激发条件根据样品尺寸进行调整，遵循引言中所述的波长准则。对于较小的球体（a、b；237至277 μm），使用10至25 kHz调频信号，确保剪切波长小于球体直径，同时避免过度衰减。对于较大的球体（c、d；660至823 μm），其尺寸允许更长波长，因此使用单周期5 kHz正弦脉冲；其短暂持续时间（0.2 ms）产生宽带频谱，其中色散脊线定义良好的2至6 kHz范围用于分析。

调频激发信号使用Hann函数进行窗处理，以减少频谱泄漏并提供渐进的振幅过渡，从而限制激发开始和结束时的瞬态伪影。相比之下，用于较大球体的单周期5 kHz脉冲未经额外窗处理。

仿体和小球体测量的记录帧率为210,000 fps，大球体测量的记录帧率为100,000 fps；两者均满足所分析频率的奈奎斯特-香农采样准则。放大倍数和视场（FOV）根据每次测量进行调整：仿体和较小球体测量（FOV≈750 μm）以及球体(c)测量（FOV≈1240 μm）使用5×物镜，较大球体(d)测量（FOV≈2050 μm）使用3×物镜。

仿体和较小球体序列（5×，210,000 fps）的物方像素间距约为1.95 μm，球体(c)（5×配更宽视场，100,000 fps，使用变焦镜头设定）约为1.95 μm，球体(d)（3×，100,000 fps）约为3.25 μm。

2.3 数据处理与粘弹性参数反演

使用Matlab（MathWorks, Inc.）中的自定义脚本处理高速图像序列，通过多步流程将记录的图像序列转换为定量粘弹性参数。

图 4 展示了整体工作流程。

图 4
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在 23% 聚丙烯酰胺样品中进行高频面内剪切波测量的处理流程。（a）采用 Hann 窗口对宽带啁啾激励进行加权（10 至 25 kHz）。（b）该激励经压电换能器传输至聚丙烯酰胺凝胶，凝胶中含有薄层硼硅酸盐微珠（直径 ≤ 25 μm），用于明场透射成像。（c）使用密集光流算法估计二维位移场，剪切波沿 ?? 方向传播，颗粒运动主要沿 ?? 方向。（d）覆盖整个视场的感兴趣区域，可视化于时空位移图中。（e）位移场通过二维傅里叶变换转换至 ?? 空间，据此提取色散曲线。（f）生成信号与记录信号之间的频谱比较，显示两者高度吻合。

帧间垂直位移场 ????(??,??,??) 使用密集 Farneb?ck 光流方法[38] 估计。选择该方法的原因是它能提供空间连续的位移场，并以足够的分辨率捕捉高频剪切波，同时尽可能减少空间混叠。

算法的参数经调优，以在噪声抑制与相位保持之间取得平衡（金字塔缩放 0.5，三级金字塔，15 像素窗口，三次迭代，多项式展开 ??=5、??=1.2）。该配置在保持相位信息的同时生成了空间连续的位移场。

15 像素的光流窗口在 5× 物镜下设定了位移分析的有效空间分辨率，约为 30×30 μm2，在 3× 物镜下按比例缩放。在样品与类器官中分析的剪切波长（≈114 至 385 μm）对应角波数 ????=2π/??≈1.6 至 5.5×10? rad/m，远低于空间奈奎斯特极限（5× 物镜下 ??/Δ??≈1.6×10? rad/m，3× 物镜下 ≈9.8×10? rad/m）。

感兴趣区域（ROI）的选取使其空间范围 ?? 设定的波数分辨率 Δ????≈2π/?? 足够精细，从而在分析频率范围内定位色散脊线 ????(??)；同时沿横向（?? 方向，即垂直于传播方向）取平均可提高信噪比并降低测量不确定性。

为分离前向传播的波，在二维频率–波数域中使用方向滤波器，通过将相应波数分量置零来去除反向传播的反射波[39]。在方向掩膜边缘应用 Hann 窗口，以避免频率分量的急剧截断。

经方向滤波后的场 ????(??,??) 通过二维快速傅里叶变换（FFT）转换至频率–波数域（????,??），以提取色散关系[40]。剪切波能量在该域中形成一条谱脊，对每个角频率 ??，识别出峰值波数 ????(??)。据此，通过标准关系 ????(??)=??/????(??) 得到相位速度色散曲线 ????(??)。最小可分辨波长 ??min 由色散图中的最大可分辨波数估计得出。

对于粘弹性表征，采用经典 Kelvin–Voigt（KV）模型（??,??），因为它能提供两个可解释的参数，并且广泛用于生物材料表征[10]。

为评估是否需要更一般化的流变描述，还使用分数阶 Kelvin–Voigt 模型（指数 0≤??≤1）对色散曲线进行拟合。估计的指数值接近于 1（??=0.81 至 1.09），表明所测行为可由经典 Kelvin–Voigt 形式良好近似。尽管柔软生物材料常表现出表观幂律流变行为，但分数阶模型在足够窄的频率范围内会退化为整阶极限。

在本测量中，可访问的频率带宽约为 0.70 个十倍频程（5 至 25 kHz），在此范围内分数阶色散与 Kelvin–Voigt 行为几乎无法区分。先前研究同样报告了在光学弹性成像测量相关的千赫兹范围内，Kelvin–Voigt 模型具有可靠性能[23,41,42]。

图 4(d) 中的时空表示显示了随传播距离变化的频率依赖衰减，高频分量衰减得比低频分量更快。该行为与 Kelvin–Voigt 模型所预测的粘性损耗一致，其衰减系数满足 ??(??)∝??2η/(2μ????)。这些观察结果表明，测量捕捉到了与粘弹性耗散预期一致的衰减趋势。

2.4 数值验证与分析框架

为验证数据处理与反演流程的可靠性与内部一致性，在 COMSOL Multiphysics? v6.2 中实现了有限元模型。在受控、无噪声条件下，为具有代表实验观测范围参数的粘弹性介质生成了合成位移场，并对其进行分析，以评估 ?? 与 η 的恢复精度。

在上下及右侧边界设置完美匹配层（PML）以抑制反射，并在左侧边界施加 10 μm 的预设垂直位移。施加频率范围 5 至 50 kHz（用于测试上限）、步长 5 kHz 的单频谐波激励，以模拟实验激励的单个频谱分量。对每个频率，稳态频域分析计算谐波位移场以表征衰减与色散。

有限元网格采用矩形二次 Lagrange 单元，其精度高于线性单元。最小波长（??min）每波长 10 个单元的密度确保了在最高模拟频率下的精度。使用直接频域求解器（MUMPS）计算稳态响应。

剪切波速度直接通过 COMSOL 结果结合相位梯度方法[43]获得。通过 LiveLink 提取复位移场 ??(??,??)，并选择与实验视场相当的感兴趣区域（图 5）。

图 5
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通过频域有限元模拟获得的 23% 聚丙烯酰胺凝胶模型中模拟的剪切波位移场（????）。虚线框标示感兴趣区域（ROI），其选取与典型实验视场相匹配。

该相位梯度方法提供了对 COMSOL 频域结果的独立验证。相比之下，实验时域位移数据使用第 2.3 节所述的 ?? 空间框架进行处理。两种方法所获速度与预设材料参数的一致性以及它们之间的吻合，支持了实验测量与整体反演框架的准确性（参见结果部分，表 1 与表 2）。

表 1
在 5 至 25 kHz 范围内通过模型拟合得到的有效粘弹性参数：剪切模量（μ）、粘度（η）、最小可分辨波长（λmin）以及分数阶指数（α）。α 值接近于 1，支持在研究带宽内使用经典 Kelvin–Voigt 近似。

| 浓度 (%) | μ (kPa) | η (Pa·s) | λmin (μm) | R2 | CVμ (%) | CVη (%) | KV 分数阶 α |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 15 | 0.70±0.24 | 0.027±0.002 | 113.96 | 0.97 至 0.98 | 34.5 | 7.1 | 1.093±0.053 |
| 17 | 1.94±0.37 | 0.060±0.007 | 164.64 | 0.95 至 0.97 | 19.1 | 12.4 | 0.973±0.047 |
| 20 | 4.67±0.48 | 0.103±0.001 | 202.36 | 0.92 至 0.96 | 10.3 | 1.2 | 0.931±0.063 |
| 23 | 10.14±0.72 | 0.145±0.029 | 232.70 | 0.95 至 0.96 | 7.1 | 20.3 | 0.809±0.048 |
| 26 | 19.31±2.71 | 0.215±0.023 | 277.81 | 0.88 至 0.98 | 14.1 | 10.7 | 0.852±0.151 |

表 2
不同浓度下根据 Kelvin–Voigt 模型得到的弹性（μ）与粘度（η）模拟值、最小波长（λmin），以及定量 FEM–实验吻合度指标。

| 浓度 (%) | μ (kPa) | η (Pa·s) | λmin (μm) | RMSE (m/s) | 误差 (%) | R2 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 15 | 0.70 | 0.027 | 108.38 | 0.063 | 2.14 | 0.983 |
| 17 | 1.92 | 0.062 | 162.66 | 0.069 | 1.95 | 0.989 |
| 20 | 4.68 | 0.102 | 204.37 | 0.101 | 2.24 | 0.983 |
| 23 | 10.15 | 0.144 | 232.42 | 0.133 | 2.53 | 0.968 |
| 26 | 19.25 | 0.213 | 286.98 | 0.152 | 2.47 | 0.962 |

2.5 数据分析

所有定量数据均以均值 ± 标准差（SD）表示。对于幻影样品验证，每个水凝胶浓度分析三个独立制备的样品。每个幻影样品作为单独批次聚合，测量在每个幻影样品相当的中心感兴趣区域进行。

测量在四个 MEL-1 细胞系黑色素瘤类器官上进行，各批次独立培养，尺寸涵盖一定范围（约 1000 至 20,000 个接种细胞；直径 237 至 823 μm），作为技术可行性的概念验证。样品数量受限于需将每个类器官置于千赫兹频率下的剪切波传播范围内，这限制了测量通量。

未进行统计假设检验，因为本研究的主要目标是验证测量平台的方法学，而非生物学推断。

3 结果

3.1 幻影样品的粘弹性

通过对 5 至 25 kHz 范围内实验色散数据拟合 Kelvin–Voigt 模型得到的有效剪切模量（??）与粘度（??）汇总于表 1。

两个参数均随聚丙烯酰胺浓度单调增加。例如，剪切模量从 15% 凝胶的 0.70±0.24 kPa 增加到 26% 凝胶的 19.31±2.71 kPa。类似地，在同一浓度范围内，粘度从 0.027±0.002 增加到 0.215±0.023 Pa·s。

Kelvin–Voigt 模型拟合在所有浓度下均表现出良好吻合（??2>0.88，表 1）。对于剪切模量，变异系数（??????）通常随浓度增加而降低（从 34.5% 降至 14.1%），表明在更高凝胶刚度下测量重复性提高。相比之下，????η 表现出更大变异性，范围从 1.2% 至 20.3%，但仍处于粘弹性表征可接受的范围内。

各浓度下相位速度（????）与波长（??）随频率的变化关系如图 6(a) 所示。在所有浓度下，相位速度均随频率单调增加。在任何给定频率下，更高聚丙烯酰胺浓度产生更高相位速度，这与表 1 中报告的刚度递增一致。

图 6
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浓度从 15% 至 26% 的聚丙烯酰胺凝胶中，剪切波相位速度（????，上）与波长（??，下）作为频率（5 至 25 kHz）的函数比较。（a）从聚丙烯酰胺幻影样品获得的实验结果，波长由所测波数计算得出。（b）在 COMSOL 中进行的有限元模拟。两组数据均显示 ???? 随频率和凝胶浓度增加而增大，相应地 ?? 减小。

最小可分辨剪切波长（??min）（表 1）在各幻影样品浓度范围内从 113.96 至 277.81 μm。这意味着，从理论上讲，如果类器官表现出相同范围的性质，则可在多细胞尺度上进行力学探测。

误差棒表示 ??=3 个独立重复样本的标准差。

3.2 数值模拟验证

模拟复现了实验观测到的主要特征，包括剪切波传播的频率依赖行为（图 6）。

从模拟数据得到的相位速度色散曲线 ????(??) [图 6(b)] 呈现出与实验结果 [图 6(a)] 一致的频率和浓度趋势。

实验与 FEM 相位速度色散曲线的定量比较显示，在所有浓度下吻合度都很强，均方根误差低于 0.16 m/s（平均相对误差 <3%），决定系数 ??2>0.96（表 2）。这些结果与研究频率范围内的 ?? 空间反演方法及 Kelvin–Voigt 本构模型一致。

对模拟幅值衰减的分析（图 7）显示，高频剪切波衰减更快，且在更硬的凝胶（例如 23% 浓度）中传播距离比在较软的凝胶（例如 15% 浓度）中更远，这与理论预测一致。

图 7
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通过 COMSOL 模拟获得的聚丙烯酰胺凝胶中模拟剪切波幅值衰减比较。面板 (a) 显示 15% 凝胶结果，面板 (b) 显示 23% 凝胶在 5 至 50 kHz 激励频率范围内的结果。曲线除颜色外，还通过线型和线宽区分。Max Dist 为幅值衰减至 0.05 μm 时的传播距离。相比较硬的 23% 凝胶，较软的 15% 凝胶表现出更大的衰减（更快的幅值衰减）。

3.3 肿瘤类器官的剪切波传播与力学特性

随后，将微弹性成像系统应用于嵌入 23% 聚丙烯酰胺凝胶中的不同尺寸（237 至 823 μm 直径）黑色素瘤肿瘤类器官，以展示其可行性，如第 2.2 节所述。

该系统捕捉到剪切波在类器官结构中的传播，细胞架构提供了足够的内源性对比，使光流算法能够在无需外源对比剂的情况下跟踪位移。图 8 显示了代表性类器官中剪切波传播期间时空位移场（????）的代表性瞬时图像。

图 8
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嵌入 23% 聚丙烯酰胺凝胶中的黑色素瘤类器官（直径约 277 μm）内剪切波传播（???? 位移）的时空瞬时图像。各帧显示了剪切波随时间在类器官中的传播，其中 ?? 从显示的第一帧开始测量，210,000 fps 记录中每隔一帧显示一次。所有面板共享相同的颜色标尺。

对每个类器官，使用 ?? 空间方法分析 ROI 内的波传播，并拟合至 Kelvin–Voigt 模型；对图 9 所示代表性类器官，得到有效粘弹性参数为 ??=0.713 kPa 和 η=0.033 Pa·s（??2=0.97）。

图 9
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代表性黑色素瘤类器官中剪切波的频率–波数分析。（a）横向位移场二维傅里叶变换 ????(????,??) 的幅值，其中提取出的谱脊（实线）及 Kelvin–Voigt（KV）拟合（虚线）。（b）脊线波数 ???? 与频率（实线）比较 KV 色散（虚线）；阴影标记拟合中排除的频率。（c）横向位移的解包裹空间相位剖面 ??(??)，带内（实线）与带外（虚线）。（d）剪切相位速度 ????(??)，带内数据点（实心）、带外数据点（空心）及 KV 拟合（实线）。

图 9 阐明了用于提取剪切粘弹性参数的频率–波数分析，特别说明了拟合频带的界定准则。横向位移场的二维傅里叶变换 ????(????,??) 将其能量集中于一条单一脊线上[图 9(a)]，对应对应的剪切传播模态。该脊线的波数作为频率的函数被追踪[图 9(b)]，在中间频率范围内与 Kelvin–Voigt（KV）色散关系重合，而在两端则偏离，每一处的偏离反映了测量中一个不同的极限。

在激励频带的下边缘，传播脊线不再能被可靠地分辨。

这可以直接从空间相位分布中观察到 [图9(c)]：在10 kHz处，位于10至25 kHz啁啾的渐缩下边缘附近，由于注入能量较低，展开相位 φ(x) 基本平坦，沿传播方向没有可察觉的梯度，这与带内观测到的单调相位斜坡形成对比。相位梯度的缺失（?φ/?x ≈ 0）以及 f-k 谱中峰脊的模糊化 [图9(b)]，表明在该频率下无法可靠提取相干传播波前；因此，相应的表观相位速度不具物理意义，这些频率在拟合中被排除。这一下限由激发和恢复的峰脊决定，而非由第2.2节的几何分辨率判据决定：在这些频率下，剪切波长（λ ≈ 150至200 μm）仍小于球体直径。

在上边缘，峰脊以相反方式偏离KV色散，在15.3 kHz以上发生转折。在此范围内，粘性衰减日益限制剪切波在球体内部传播的距离，使得相干模式不再能维持在整个视野范围内：k空间峰脊失去定义并弯曲回折 [图9(b)]，且提取的速度偏离模型 [图9(d)]。这一上限与23%凝胶浓度下的模拟振幅衰减（图7）一致，后者表明在20 kHz时超过约400 μm即接近完全衰减。这些频率同样被排除。

在这两个极限之间，存在剪切波真正传播的频带：相位随位置单调推进，峰脊遵循KV色散，且相位速度能被模型良好描述。因此，粘弹性拟合被限定在此窗口内（对于较小的球体为12至15 kHz）。相同的判据——存在传播模式且色散与KV模型一致——被用于定义每个球体的拟合频带。由于激发是根据样品尺寸匹配的（第2.2节），较大的球体在较低频率下被探测，并在相应更低的频带（2至6 kHz）内保留了分辨良好的传播模式。

由于这些较大的球体在明场透射中显得较暗（图10），这可能影响光流跟踪，因此该判据也作为跟踪质量的检验：如果光流未能跟踪位移场，则不会恢复出单调相位梯度和遵循KV色散的清晰峰脊。对于球体(c)和(d)，在2至6 kHz频带内均恢复了这两个特征，其Kelvin-Voigt拟合分别得到 R2 = 0.97 和 0.99（图10）。

图10 下载 全尺寸图像
四个黑素瘤球体(a)–(d)的代表性球体图像和相应的力学特性，显示细胞数、直径、分析频带和有效Kelvin-Voigt参数（μ, η, R2）。

四个球体的有效粘弹性参数汇总于图10。有效剪切模量范围为0.450至0.713 kPa，粘度范围为0.033至0.097 Pa·s，所有情况下 R2 ≥ 0.96。由于分析频带在各样品之间不同，这些有效参数不能跨球体直接比较，作为可行性估计而非绝对材料属性报告。这些球体也是不同尺寸的独立样品；因此，它们之间的 μ 和 η 差异尚不能与尺寸效应、生物变异性和拟合频带效应区分开来。

4. 讨论

所提出的微弹性成像平台被应用于可调谐模型和三维黑素瘤肿瘤球体的表征。该工作展示了微尺度力学定量表征的技术可行性，并提供了千赫兹频率下有效粘弹性参数的估计值。

以下讨论将这些发现置于机械生物学和弹性成像的更广泛背景中，解释其意义，讨论方法学选择和局限性，并概述该技术的未来方向。

本工作的一个重要方面是将光学微弹性成像扩展到多千赫兹近超声频段。在剪切波弹性成像中，空间分辨率从根本上受到传播波长的限制。因此，分辨此处研究的球体等微观结构（237至823 μm）需要比特征本身更小的剪切波长。

由于剪切波长与频率成反比（λ = c_s / f），激发频率必须与目标尺寸相匹配。对于较小的球体（约237至277 μm），分辨与特征尺寸相当或更小的波长需要更高的激发频率；而较大的球体（约660至823 μm）允许更长的波长，因此频率更低，这一利用单周期5 kHz激发在2至6 kHz范围内分析的方法被采用。

本平台通过根据样品尺寸调整的激发来解决这一需求，在聚丙烯酰胺模型中实现最小可分辨波长约110 μm，在球体中约150至385 μm。这一能力使得在可与微组织尺寸相当的空间尺度上进行力学表征，将剪切波弹性成像拓展到微尺度组织探测。

实验波长值（约110至280 μm，表1）在不同模型浓度间保持相当，且与恢复的相位速度一致 [图6(a)]。这些值也与此处研究的生物目标尺寸相匹配。综合来看，这些观察结果表明该系统在多细胞空间尺度上探测力学行为。

模型验证数据（表1）还突出了聚丙烯酰胺系统的特征行为。凝胶浓度从15%增加到26%，导致剪切模量增加27倍（0.70至19.31 kPa），但粘度仅增加8倍（0.027至0.215 Pa·s）。

这一响应与底层聚合物物理一致。在聚丙烯酰胺凝胶中，丙烯酰胺:双丙烯酰胺比（本研究中为19:1）主要影响粘性响应，而交联密度（随总单体浓度变化）则主要控制弹性行为[44,45]。粘度主要受骨架摩擦影响，而刚度随交联密度缩放[46,47]。

这一行为也反映在独立重复实验中观察到的变异系数上（表1），粘度的变异系数普遍小于剪切模量（CV_η = 1.2% 至 20.3%，CV_μ = 7.1% 至 34.5%）。

我们的系统应用于四个黑素瘤球体，在其各自探测频带内得到有效剪切模量 μ ≈ 0.45 至 0.71 kPa，有效粘度 η ≈ 0.03 至 0.10 Pa·s。这些值在相对较少被探索的频率范围内，为肿瘤球体模型提供了粘弹性参数的定量估计。

测得的剪切模量与其他技术（如原子力显微镜（AFM）和磁微弹性成像）报告的肿瘤球体值基本一致，后者通常在几百帕到几千帕之间[48–51]。然而，它比报道的切除人体黑素瘤组织的刚度值（约25.6 kPa）[52]低大约一个数量级。

这一差异很可能至少部分反映了肿瘤球体与体内成熟肿瘤之间的生物学差异，而非实验伪影。几个因素可能导致体内肿瘤报道的更高刚度。首先，成熟肿瘤具有致密、高度交联和重塑的细胞外基质（ECM），这一过程由癌症相关成纤维细胞驱动，而我们的单培养系统中不存在[53,54]。其次，在受限生理环境中生长的肿瘤经历显著的固体压缩应力，这可以增加其表观刚度[55,56]。

重要的是，肿瘤力学包含的不仅仅是刚度；粘弹性性质也影响癌症进展和治疗反应[3]。通过将癌细胞与其基质环境隔离，我们的系统主要探测癌细胞集合的固有机械行为[57]。

此外，虽然我们的分析为每个球体产生一个总体有效值，但时空位移数据（图8）提供了波传播空间变化的定性指示。定性视觉检查表明，剪切波在球体周边附近的传播速度略快，且衰减更强，而不是核心区域。

这一定性模式与肿瘤球体中报道的周边硬化机制兼容，包括细胞密度增加、细胞-细胞粘附增强和新生细胞外基质沉积[27,58,59]。然而，在弯曲的凝胶-球体界面的波散射和衍射也可能对观察到的表观波速度空间变化有所贡献。准平面剪切波与机械阻抗显著不同的球形嵌入体的相互作用，即使在机械均质目标中也能产生空间非均匀的位移场[35]。

区分真正的机械异质性和波传播伪影将需要空间分辨的反演方法或全波散射问题的数值建模，这代表了未来的重要方向。

4.1. 局限性和未来方向

弹性成像研究中一个常见的方法学局限性是使用双参数Kelvin-Voight模型，该模型简化了生物组织复杂的流变学，后者通常表现出幂律或分数阶粘弹性行为[10,46,47]。在本研究中，分数阶Kelvin-Voigt拟合得到的指数始终接近于1（各模型中 α ≈ 1），表明在5至25 kHz带宽内，经典公式为观测到的色散行为提供了合理的近似[41,42]。然而，更宽带宽研究可能从分数阶模型中受益。

分析还假设在赤道感兴趣区域内局部波前是平面，而不是构建体本身的平面性，这是声辐射力激发的圆柱波前通常所做的假设，在离源足够远处被视为局部平面。感兴趣区域的选择最小化了边界条件、衍射和光学畸变的影响，确保测量响应主要反映球体的固有机械行为。这对于肿瘤球体典型的近似椭球几何是足够的，但明显不规则的构建体将需要全波散射问题的建模或局部分辨的反演。

此外，虽然空间分辨的方法如局部相位梯度法[43,60]、逐像素重建[61,62]或噪声相关技术[63,64]提供了映射机械异质性的强大策略，但此处采用的空间平均方法适用于本研究的平台验证和有效属性目标。未来的工作应实施这些更高分辨率的方法，以全面量化球体测量中定性观察到的机械梯度。在本球体实验中，高频下有限的传播距离和构建体跨度的小波长数量有利于稳健的感兴趣区域平均估计，而非局部逐像素反演。

进一步的局限性在于嵌入凝胶（μ ≈ 10.14 kPa）和球体（μ ≈ 0.45 至 0.71 kPa）之间的机械阻抗失配。这一对比可能在凝胶-球体界面引入残余波散射和部分反射，可能影响估计的粘弹性参数。虽然方向滤波抑制了反射波分量[39]，且赤道感兴趣区域选择最小化了曲率引起的衍射效应，但不能完全排除界面介导的波畸变。未来的工作应研究阻抗匹配的嵌入介质或波散射校正模型，以更好地分离球体的固有机械响应。

所有测量均在环境温度（22°C 至 24°C）下进行，没有主动热控制。由于软组织的热粘弹性本质，这可能会引入系统偏差，其幅度和方向取决于具体的材料特性[65,66]。虽然某些组织在生理温度下变硬，但其他组织如脑组织显著变软，意味着环境测量可能高估或低估体内属性[67,68]。这种敏感性在本研究使用的丙烯酰胺基模型中尤为明显。因此，纳入温控台以将样品维持在37°C，是向提高生理相关性迈进的重要一步。

本研究的生物范围是有意限制的。测量是在单一细胞系、不同尺寸的四个黑素瘤球体上进行的，构成技术可行性的概念验证演示，而非具有统计功效的生物学表征。因此，报道的粘弹性参数应解释为指示性估计，而非黑素瘤球体力学的代表性值。稳健的生物学结论需要对相同样品的重复性测量以及额外细胞系和重复的测量，包括引入癌症相关成纤维细胞和基质细胞的共培养模型，以更好地重现肿瘤微环境[69]。

最后，当前方法仅限于光学透明或半透明样品。然而，测量表明黑素瘤球体提供了足够的内源性光学对比度用于位移跟踪。要将适用范围扩展到不透明的离体组织 specimen，未来的工作将探索将高频驱动和分析框架与提供更深穿透深度的成像模态相结合，如光学相干断层扫描[70]。

5. 结论

本工作证明了千赫兹范围的三维生物构建体在亚毫米分辨率下的粘弹性表征。光学微弹性成像平台结合使用压电执行器的准平面剪切波激励、高速成像（高达210,000 fps）和k空间色散分析，通过Kelvin-Voight模型估计频率依赖性粘弹性参数。

在跨越0.70至19.31 kPa的聚丙烯酰胺模型上的验证，在5至25 kHz频率范围内展示了稳健性能，实验相位速度色散与有限元预测高度一致（均方根误差 < 0.16 m/s，平均相对误差 < 3%，R2 > 0.96）。

在体模中可分辨的最小剪切波长约为110 μm，证实了在多细胞尺度上有效的机械探测能力。将该方法应用于四个黑色素瘤肿瘤球体（直径237至823 μm），在各样本特定的分析频段内获得了有效粘弹性参数 μ=0.450至0.713 kPa 和 η=0.033至0.097 Pa·s（R2≥0.96），证明其在具有生物学意义的三维构建体中的可行性。未来通过更大样本量和多种细胞系的研究，将建立生物学推断所需的统计稳健性。这种准平面激励方法减少了与传统点源方法相关的几何扩散伪影，提供了一种用于研究机械生物学和组织工程中频率依赖性机械行为的非侵入性光学工具。该平台为在千赫兹频率下对工程化组织构建体和三维生物模型进行定量粘弹性表征奠定了基础。