基于辣木（Moringa oleifera）植物化学物的普马拉病毒（PUUV）入侵糖蛋白Gn与Gc双重靶点抑制：一项综合计算研究

《Bioinformatics and Biology Insights》：Dual-Target Inhibition of Puumala Virus Entry Glycoproteins Gn and Gc by Moringa oleifera-Derived Phytochemicals: An Integrated Computational Study

　　

摘要专业翻译 普马拉病毒（Puumala virus, PUUV）属于正汉坦病毒属（Orthohantavirus），可引起肾综合征出血热（hemorrhagic fever with renal dysfunction）的中间型——流行性肾病（nephropathia epidemica），目前尚无获批的抗病毒疗法。病毒入侵由附着糖蛋白Gn与融合糖蛋白Gc的协同作用启动，因此同时抑制这两种蛋白是一种颇具吸引力的抗病毒策略。本研究采用整合计算工作流程，从辣木（Moringa oleifera）植物化学物中筛选PUUV入侵糖蛋白的双重靶点抑制剂。研究人员检索获得72种植物化学物，通过分子对接（molecular docking）鉴定高亲和力结合物，随后对排名靠前的化合物进行类药性（drug-likeness）、药代动力学行为、毒性及预测生物活性评估，以判断其治疗适用性。进一步通过100 ns分子动力学模拟（molecular dynamics simulations, MDS）及MM-GBSA结合自由能计算考察复合物稳定性与结合机制。槲皮素（quercetin）和山柰酚（kaempferol）对Gn（?9.8和?9.7 kcal/mol）及Gc（?10.4和?10.0 kcal/mol）分别表现出最低结合能。两种植物化学物均展现出良好的类药特性、高胃肠道吸收、无预测毒性及阳性生物活性评分。MDS证实蛋白质-配体复合物结构稳定、结构波动极小，MM-GBSA分析进一步验证了强结合，其中槲皮素对Gn（?84.24 kcal/mol）和Gc（?98.45 kcal/mol）表现出最优结合自由能。上述发现将槲皮素和山柰酚鉴定为有望同时阻断PUUV附着与膜融合过程的双重靶点抑制剂，值得进一步的实验验证。

论文解读

一、研究背景与意义

汉坦病毒（Hantaviruses, HTNV）属于汉坦病毒科（Hantaviridae）正汉坦病毒属（Orthohantavirus），是一类新发现的人兽共患病原体，为有包膜、负义单链RNA病毒，主要通过吸入感染啮齿动物宿主的雾化排泄物传播给人类。全球每年有超过20万人感染汉坦病毒，且其地理分布范围和发病率在世界许多地区持续上升，构成重要的公共卫生挑战。汉坦病毒感染主要引起两种临床综合征：在欧亚大陆更为常见的肾综合征出血热（hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS）以及在美洲更为常见的汉坦病毒心肺综合征（hantavirus cardiopulmonary syndrome, HCPS）。

普马拉病毒（Puumala virus, PUUV）是欧洲最流行的汉坦病毒物种之一，是轻至中度HFRS变体——流行性肾病（nephropathia epidemica）的主要病因。该病毒以欧岸??（Myodes glareolus）为天然储存宿主。人类感染可导致急性发热性疾病，伴有肾功能损害、血小板减少、血管渗漏，严重时可出现危及生命的并发症。尽管支持性治疗仍是临床管理的基石，但缺乏获批的抗病毒药物凸显了针对PUUV感染寻找新治疗策略的重要性。

PUUV感染的启动由两种病毒包膜糖蛋白Gn和Gc介导，二者在病毒进入宿主细胞过程中发挥关键作用。Gn糖蛋白主要作为附着蛋白，促进病毒对易感宿主细胞表面受体的识别与结合；受体结合后，Gc糖蛋白作为II类融合蛋白发生构象重排，促进病毒包膜与宿主细胞膜融合，使病毒基因组释放至细胞质。由于病毒附着和膜融合是汉坦病毒生命周期中不可或缺的步骤，同时抑制Gn和Gc糖蛋白代表了一种能够在感染最早期阻断病毒的有吸引力的抗病毒策略。

天然产物因其结构多样性和广泛的药理活性，一直是抗病毒药物发现中生物活性化合物的重要来源。其中，辣木（Moringa oleifera）因其丰富的植物化学物含量而受到广泛科学关注，包括生物碱、酚酸、黄酮类、硫代葡萄糖苷、异硫氰酸酯、鞣质和萜类化合物。已有研究表明辣木具有抗氧化、抗炎、抗菌、免疫调节和抗病毒活性。计算药物发现方法的近期进展通过分子对接、药代动力学评估、毒性预测、分子动力学模拟（MDS）和结合自由能计算加速了有前景治疗候选物的识别。因此，本研究旨在利用整合计算框架，从辣木来源的植物化学物中鉴定PUUV附着糖蛋白Gn和融合糖蛋白Gc的潜在双重抑制剂。

二、研究设计与主要技术方法

研究人员采用整合计算工作流程开展研究。首先从IMPPAT 2.0和PubChem公共植物化学物数据库中检索辣木的植物化学物，去重后共获得72种化合物。使用SWISS-PdbViewer对配体三维结构进行能量最小化。靶蛋白PUUV附着糖蛋白Gn（PDB ID: 5FYN）和融合糖蛋白Gc（PDB ID: 5J81）的三维结构从RCSB PDB数据库获取，经BIOVIA Discovery Studio 4.5预处理去除结晶水、结合配体等非必需分子后，使用SWISS-PdbViewer进行能量最小化。利用CASTpFold服务器预测两种糖蛋白的潜在配体结合口袋。分子对接使用PyRx（集成AutoDock Vina 1.2.0）进行，对72种植物化学物分别与Gn和Gc进行盲对接。排名靠前的化合物进一步通过admetSAR 3.0、SwissADME、Deep-PK和pkCSM等平台进行类药性、药代动力学和毒性预测，并使用Molinspiration服务器预测生物活性。对最有前景的化合物采用Schr?dinger Maestro Desmond软件包（OPLS4力场）进行100 ns分子动力学模拟，分析RMSD、RMSF、Rg和SASA等参数评估复合物稳定性。最后使用Prime模块的MM-GBSA方法计算结合自由能。

三、主要研究结果

3.1 PUUV糖蛋白Gn和Gc潜在活性位点的鉴定

CASTpFold预测结果显示，Gn糖蛋白的结合口袋包含Thr37、Ile38、Gly39、Leu40、Gly41、Gln42、Gly43、Ile156、Thr181、Tyr182、Cys183、Val184、Ser185、Gly186、Gln187、Val189、Cys193、Phe194、Asn195、Pro196、Val197、His198、Thr199、Tyr209、Val259、Gly260、Ser261、Ser262、Ser263、Glu264、Pro265、Leu266、Tyr274、Arg275、Leu376、Glu379和Ile380等残基。Gc糖蛋白的预测结合口袋包含Asp669、His672、Ile726、Gln727、His728、Leu729、Gly730、Lys805、Ile806、Val807、Ile835、Cys873、Thr874、Thr875、Gly883、Met886、Thr888、Pro889、Thr890、Lys893、Thr945、Gly995、Val996、Gly997、Gly1046、His1047、His1056、Asp1057、His1071、Leu1072、Asp1073和Arg1074等残基。

3.2 分子对接鉴定PUUV糖蛋白的有前景双重抑制剂

通过分子对接筛选，槲皮素、山柰酚、莰烯（camphene）和β-红没药烯（β-bisabolene）对两种糖蛋白均表现出最强且最一致的结合亲和力。对Gn，槲皮素结合能最高（?9.8 kcal/mol），其次为山柰酚（?9.7 kcal/mol）、莰烯（?8.9 kcal/mol）和β-红没药烯（?8.7 kcal/mol）。对Gc，槲皮素同样最强（?10.4 kcal/mol），其次为山柰酚（?10.0 kcal/mol）、莰烯（?9.5 kcal/mol）和β-红没药烯（?9.0 kcal/mol）。

3.3 类药性与药代动力学特性预测

槲皮素分子量302.24 g/mol，MLogP为?0.56，7个氢键受体（HBA），5个氢键供体（HBD），TPSA为131.36 ?2；山柰酚分子量286.24 g/mol，MLogP为?0.03，6个HBA，4个HBD，TPSA为111.13 ?2。两者均完全满足利平斯基五规则（Lipinski's rule of five），零违反。莰烯和β-红没药烯各有一个违反，且无HBD和HBA基团，TPSA为0 ?2。药代动力学预测显示，槲皮素和山柰酚具有高胃肠道吸收，而莰烯和β-红没药烯吸收较低。四种化合物生物利用度评分均为0.55。槲皮素和山柰酚被预测为不可穿透血脑屏障（BBB），莰烯和β-红没药烯则可穿透BBB。莰烯和β-红没药烯被预测抑制CYP2C9，而槲皮素和山柰酚无此抑制作用。槲皮素和山柰酚为P-糖蛋白（P-gp）底物。

3.4 毒性预测

四种化合物均未预测出Ames致突变性或肝毒性。口服急性毒性LD₅₀值分别为槲皮素2607 mmol/kg、山柰酚2197 mmol/kg、莰烯1611 mmol/kg和β-红没药烯1597 mmol/kg。皮肤致敏性分析预测槲皮素、山柰酚和莰烯为非致敏性，而β-红没药烯具有皮肤致敏潜力。综合评估确定槲皮素和山柰酚为最有前景的候选物。

3.5 最有前景植物化学物的生物活性预测

槲皮素在GPCR配体、离子通道抑制剂、激酶抑制剂、核受体配体、蛋白酶抑制剂和酶抑制剂方面的评分分别为0.95、0.80、0.60、0.78、0.61和0.92；山柰酚相应评分为0.91、0.70、0.50、0.64、0.55和0.95。但研究人员指出，这两种化合物具有多酚骨架，可能与混杂靶标相互作用，阳性评分可能部分反映骨架依赖性混杂性而非实验确认的靶标特异性活性。

3.6 分子对接可视化和相互作用分析

在Gn结合口袋中，山柰酚与Gln187形成两个常规氢键，并与Pro196、Ser263和Arg275分别形成π-烷基、π-σ和π-阳离子相互作用。槲皮素与Leu40、Gln187和Ser262形成常规氢键，与Pro196形成π-烷基相互作用，与His198存在不利的供体-供体相互作用。在Gc结合口袋中，山柰酚与Leu729形成常规氢键，并与Leu729和Thr888形成π-σ相互作用、与Leu1072形成π-烷基相互作用。槲皮素与Asp669、Ile835和His1056形成常规氢键，与His672形成π-π堆积相互作用，与Ile835和Asp1057分别形成π-烷基和π-阴离子相互作用。所有相互作用残基均位于CASTpFold预测的活性位点区域内。

3.7 所选复合物的动态稳定性评估

100 ns MDS结果表明，四种复合物（山柰酚Gn、槲皮素Gn、山柰酚Gc、槲皮素Gc）在整个模拟期间均保持结构稳定。RMSD分析显示各复合物在初始平衡期后波动极小，Gn复合物RMSD主要在1.2–1.7 ?之间，Gc复合物主要在0.9–1.5 ?之间。RMSF分析显示大多数残基波动低于1.0 ?，仅少数环区或末端区域表现出较高灵活性。Rg分析确认各复合物保持结构紧凑性，山柰酚复合物Rg值（约1.1–1.3 nm）低于槲皮素复合物（约1.4–1.7 nm）。SASA分析显示各复合物溶剂暴露适中，槲皮素_Gc复合物在60 ns后出现较大SASA波动。

3.8 蛋白质-配体相互作用分析

在整个100 ns模拟中，四种复合物的相互作用谱以水桥和氢键为主导相互作用类型，疏水接触提供额外稳定化。离子相互作用仅在槲皮素_Gc复合物中检测到，且出现频率较低。

3.8 MM-GBSA结合自由能估算

槲皮素对Gn和Gc的ΔG_bind分别为?84.24和?98.45 kcal/mol，山柰酚分别为?82.14和?96.22 kcal/mol。能量分解显示亲脂性相互作用（ΔG_bind Lipo）和范德华相互作用（ΔG_bind vdW）是复合物形成的主要驱动力，氢键贡献较小（?1.12至?2.11 kcal/mol）。两种植物化学物对Gc的结合均强于对Gn的结合。

四、讨论与结论

讨论部分指出，病毒入侵是汉坦病毒生命周期中的关键步骤，Gn介导宿主细胞附着而Gc促进膜融合，这两种蛋白对病毒感染性不可或缺且在PUUV中高度保守，是抗病毒干预的理想分子靶标。综合类药性、药代动力学和毒性评估，槲皮素和山柰酚因其良好的理化性质、可接受的ADMET特征和无预测毒性而被确定为最有前景的候选物。MDS和MM-GBSA分析一致证实两种植物化学物与两种PUUV糖蛋白形成稳定复合物，表明其作为双重靶点抑制剂同时干扰病毒附着和膜融合的潜力。研究人员同时指出研究局限性：结论完全来源于计算分析，需要实验验证；每个复合物仅进行单一100 ns MD轨迹；未进行PCA/essential dynamics和自由能景观分析。

结论部分翻译：本研究采用整合计算方法，结合活性位点预测、分子对接、ADMET评估、毒性评估、生物活性预测、MDS、蛋白质-配体相互作用分析和结合自由能计算，从辣木植物化学物中鉴定PUUV糖蛋白Gn和Gc的潜在双重抑制剂。在72种筛选化合物中，槲皮素和山柰酚成为最有效的候选物，对两种糖蛋白均表现出良好的结合亲和力、可接受的类药特性、理想的药代动力学特征、无预测毒性及广泛的生物活性谱。MDS证实蛋白质-配体复合物结构稳定，持续的氢键、水桥和有利的结合自由能进一步支持了两种植物化学物与病毒附着（Gn）和融合（Gc）糖蛋白的稳定结合。然而，这些结果仍属预测性质，需要充分的实验确认。未来涉及体外和体内研究以及药理学和机制分析的研究，对于确认这些化合物的有效性、安全性和治疗适用性至关重要。总体而言，本研究凸显了辣木来源植物化学物作为针对PUUV的新型抗病毒候选物的潜力，并为未来针对汉坦病毒感染的药物发现工作提供了有价值的框架。