靶向IL-1R1与雄激素受体的天然化合物双调控：Aconitum heterophyllum与Podophyllum hexandrum来源成分的计算机模拟及体外抗癌研究

《Frontiers in Pharmacology》：Targeting IL-1R1 and androgen receptor using natural compounds from Aconitum heterophyllum and Podophyllum hexandrum: an in silico and in vitro study

　　

背景：肺癌和前列腺癌仍是全球癌症相关死亡的主要原因，其进展受炎症介导的肿瘤促进和激素依赖性信号驱动。白细胞介素-1受体1型（IL-1R1）促进慢性炎症、转移和肿瘤存活，而雄激素受体（AR）信号是前列腺癌生长的核心驱动因素。同时靶向炎症和雄激素通路是克服治疗耐药的有前景策略。目的：本研究旨在采用实验与计算整合方法，评价源自Aconitum heterophyllum（阿替辛、亚油酸）和Podophyllum hexandrum（鬼臼毒素）的天然化合物作为IL-1R1和AR调节剂。方法：通过Soxhlet提取法从A. heterophyllum块根和P. hexandrum果实中提取植物化学物，并用薄层色谱（TLC）和柱色谱分离。在A549（肺癌）和LNCaP（前列腺癌）细胞系中采用MTT和集落形成实验评估细胞毒性和长期抗增殖效应。计算分析包括ADMET（吸收、分布、代谢、排泄和毒性）分析、针对IL-1R1（PDB: 1ITB）和AR（PDB: 2YHD）的分子对接、100 ns分子动力学模拟、MM-GBSA结合自由能计算、基于网络药理学的靶点及通路富集分析。结果：鬼臼毒素在A549和LNCaP细胞中均显示强细胞毒性，IC₅₀为0.04 μM，优于多柔比星；阿替辛显示中等活性（IC₅₀：2.1–2.3 μM）。亚油酸显示弱抗癌活性（IC₅₀ >100 μM）。集落形成实验证实鬼臼毒素强烈抑制克隆存活，阿替辛具有中等抑制作用。对接研究提示有利结合亲和力（?8.1至?5.9 kcal/mol），分子动力学模拟显示蛋白–配体复合物稳定且RMSD波动低。ADMET分析支持阿替辛和鬼臼毒素良好的药物相似性。网络药理学识别出133个交集靶点，关键枢纽基因包括SRC、EGFR和AKT1，富集于PI3K-Akt和癌症相关信号通路。结论：阿替辛和鬼臼毒素表现出显著抗癌活性，并显示与IL-1R1和AR有利的预测相互作用，提示其作为双重调节剂的潜力，值得进一步实验验证。其良好抗癌特征得到强细胞毒性、有利的预测蛋白–配体相互作用、可接受的药代动力学性质和多靶点网络药理学分析支持。这些发现为进一步优化和体内验证提供了初步基础，以开发靶向炎症驱动和雄激素依赖性癌症的新型抗癌治疗药物。

研究背景：癌症是全球主要健康问题，死亡率仅次于心血管疾病；2020年全球近1000万人死于癌症。肺癌和前列腺癌因耐药和转移而治疗困难，亟须干预肿瘤进展关键分子通路的治疗策略。IL-1R1（白细胞介素-1受体1型，促炎细胞因子受体）可增强慢性炎症、血管生成和细胞存活，促进肿瘤发展；AR（雄激素受体，激素依赖性转录因子）信号是前列腺癌进展和肿瘤维持的核心。因此，同时靶向IL-1R1和AR有望对抗炎症驱动和雄激素依赖性癌症。天然产物是抗癌药物的重要来源，近四分之三临床批准抗癌药来源于天然产物或其结构类似物。Aconitum heterophyllum Wall. ex Royle为濒危喜马拉雅草本，传统用于多种疾病，其主要二萜生物碱阿替辛（atisine）具有免疫调节和抗癌潜力；Podophyllum hexandrum Royle富含木脂素鬼臼毒素（podophyllotoxin，PTOX），为依托泊苷和替尼泊苷的骨架，可破坏微管组装并具有抗病毒、免疫抑制和抗炎作用，并可干扰前列腺癌AR信号。天然代谢物开发需了解药代动力学和安全性，分子对接、分子动力学（MD）模拟和ADMET分析可提供药物相似性、复合物稳定性和结合自由能信息。本研究评价阿替辛、鬼臼毒素及亚油酸（linoleic acid）对肺癌和前列腺癌的潜力，亚油酸因在A. heterophyllum甲醇提取物中丰度较高且经GC–MS和TLC导向分离而被纳入，以判断主要提取物代谢物是否贡献生物效应。研究人员在A549和LNCaP细胞中评估细胞毒性和克隆形成，并进行ADMET、分子对接和100 ns MD模拟，以提供其作为炎症和雄激素信号通路调节剂的机制见解。研究结论提示阿替辛和鬼臼毒素具有显著抗癌活性，并与IL-1R1和AR具有有利预测相互作用，可作为双重调节剂进一步验证；其强细胞毒性、预测蛋白–配体相互作用、可接受药代动力学性质和多靶点网络药理学分析支持其抗癌特征，为后续优化和体内验证提供初步基础。重要意义在于为靶向炎症驱动和雄激素依赖性癌症的新型抗癌治疗开发提供候选天然化合物和计算–体外整合证据。

关键技术方法概述：研究采用Soxhlet提取结合TLC与柱色谱分离化合物；A549和LNCaP细胞系来自认证细胞库，用于MTT和集落形成实验；ADMETlab 2.0预测ADMET；AutoDock Vina/PyRx对IL-1R1（PDB: 1ITB）和AR（PDB: 2YHD）进行分子对接；Desmond进行100 ns MD模拟；Prime MM-GBSA计算结合自由能；SwissTargetPrediction、OMIM、GeneCards、STRING、Cytoscape及ShinyGO用于网络药理学、蛋白–蛋白相互作用（PPI）和GO/KEGG富集分析。未涉及样本队列。

4.1 结构解析验证（Validation of structural elucidation）：通过TLC及¹H和¹³C核磁共振（NMR）谱确认分离化合物，所得谱图与已发表文献一致。

4.2 化合物MTT实验（MTT assay of compounds）：通过A549和LNCaP细胞MTT实验比较阿替辛、鬼臼毒素、亚油酸和多柔比星。阿替辛呈剂量依赖性细胞毒作用，IC₅₀分别为2.1 μM和2.3 μM；鬼臼毒素最强，在两种细胞中IC₅₀均为0.04 μM，优于多柔比星（0.25 μM和0.22 μM）；亚油酸作用弱，IC₅₀ >100 μM。

4.3 集落形成单位实验（Colony forming unit assay）：通过A549和LNCaP细胞集落形成实验评估长期抗增殖效应。鬼臼毒素显著抑制克隆存活（p < 0.001），阿替辛呈中等抑制（A549中p < 0.01，LNCaP中p < 0.01），亚油酸仅轻度降低且无统计学显著性。

4.4 ADMET与药物相似性评价（ADMET and drug-likeness evaluation）：通过ADMETlab 2.0预测。鬼臼毒素药物相似性较好（QED=0.763），符合Lipinski、Pfizer和GSK规则，TPSA为92.68 ?²，logS=?3.90，但血浆蛋白结合率高（97.41%）；阿替辛QED=0.683，TPSA低（32.7 ?²），但预测为P-糖蛋白（P-gp）底物，血浆蛋白结合率为66.4%；亚油酸QED=0.318，违反Pfizer和GSK规则，logS=?5.42，logP=6.95。鬼臼毒素和阿替辛可穿透血脑屏障，亚油酸无中枢神经系统穿透。结论为鬼臼毒素和阿替辛具有更有利的ADMET特征，亚油酸更适合作为辅助生物活性化合物而非先导药物。

4.5 分子对接与结合亲和力分析（Molecular docking and binding affinity analysis）：通过分子对接评价三种化合物与AR和IL-1R1的结合。对AR，结合亲和力为?8.0至?6.1 kcal/mol，鬼臼毒素最高（?8.0 kcal/mol），阿替辛为?7.2 kcal/mol，亚油酸为?6.1 kcal/mol；鬼臼毒素与GLU681、PRO682、ARG752、PHE804发生疏水作用，与TRP751、ARG752、THR755形成氢键。对IL-1R1，结合亲和力为?8.1至?5.9 kcal/mol，阿替辛最高（?8.1 kcal/mol），鬼臼毒素为?7.6 kcal/mol，亚油酸为?5.9 kcal/mol；阿替辛与GLU25、PRO131发生疏水作用，与VAL132形成氢键。亚油酸结合相对较弱，与其较低体外细胞毒活性一致。

4.6 分子动力学（MD）模拟（Molecular dynamics simulations）：对鬼臼毒素–AR和阿替辛–IL-1R1复合物进行100 ns MD模拟。两种复合物的蛋白主链RMSD（均方根偏差）和配体RMSD均稳定，RMSF（均方根涨落）显示末端和环区柔性较高而核心结构刚性。鬼臼毒素复合物二级结构中α-螺旋占52.30%、β-链占1.72%；阿替辛复合物β-链占41.79%、α-螺旋占0.24%。蛋白–配体相互作用分析显示持续氢键、疏水接触和水桥作用。MM-GBSA（分子力学广义Born表面积法）结合自由能显示鬼臼毒素0 ns为?63.63 kcal/mol、100 ns为?30.96 kcal/mol；阿替辛0 ns为?71.25 kcal/mol、100 ns为?49.77 kcal/mol。结论为两种复合物在模拟期间具有良好结合稳定性和结构相容性。

4.7 网络药理学（Network pharmacology）
4.7.1 活性成分筛选与疾病相关靶点收集：通过SwissTargetPrediction、OMIM和GeneCards数据库，限定Homo sapiens，获得327个化合物相关靶点和1299个癌症相关靶点，交集为133个靶点。
4.7.2 PPI网络构建与分析：通过STRING和Cytoscape构建PPI网络，包含133个节点和565条边，平均节点度为8.5，局部聚类系数为0.497；拓扑分析确定枢纽基因为SRC、EGFR、AKT1、PIK3CA、HSP90AA1、IL6、PIK3R1、MAPK1、PTPN11和MAPK3。
4.7.3 GO与KEGG富集分析：通过ShinyGO进行富集分析。生物学过程富集于蛋白磷酸化、化学物质应答和细胞内信号传递；细胞组分富集于囊泡、细胞连接和质膜整合；分子功能富集于蛋白丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性、激酶活性和ATP结合；KEGG通路富集于癌症通路、PI3K-Akt信号通路及PD-L1表达与PD-1检查点通路。

讨论部分总结：研究整合体外细胞毒性、ADMET、分子对接、MD模拟、MM-GBSA和网络药理学，形成连接细胞表型与分子机制的多尺度框架。鬼臼毒素细胞毒性最强并与AR强结合，提示其作为直接细胞毒和激素调节剂；阿替辛对IL-1R1结合最强且ADMET较有利，提示其作为抗炎和信号调节剂补充细胞毒治疗；亚油酸活性弱，提示辅助而非单独治疗角色。ADMET提示阿替辛和鬼臼毒素符合常见口服药物设计标准，但低人肠道吸收（HIA）可能限制口服生物利用度，鬼臼毒素高血浆蛋白结合和P-gp底物等问题需制剂优化或结构改造。网络药理学显示133个共享靶点及SRC、EGFR、AKT1、PIK3CA、MAPK1/3、IL6等枢纽基因，富集PI3K-Akt、MAPK和免疫相关通路，支持多靶点优势。研究局限为未通过qRT-PCR、Western blotting、ELISA、RNA sequencing或功能实验直接验证IL-1R1和AR相关机制，所提机制应视为初步和假设生成性。

研究结论翻译：总之，本研究证明分别从A. heterophyllum和P. hexandrum分离的天然化合物阿替辛和鬼臼毒素对肺癌和前列腺癌细胞系具有有前景的抗癌潜力。MTT和集落形成实验显示剂量依赖性细胞毒性和长期抗增殖效应，其中鬼臼毒素强于阿替辛和亚油酸。计算分析包括ADMET分析、分子对接、分子动力学模拟和网络药理学，预测了有利药代动力学性质、与AR和IL-1R1的稳定相互作用，以及PI3K-Akt信号通路等癌症相关通路的参与。然而，这些计算发现代表预测的分子相互作用，需要实验验证以确认其生物学相关性。因此，需要采用qRT-PCR、Western blotting、ELISA、RNA sequencing和体内研究等技术进一步开展机制研究，以验证预测的分子靶点和信号通路。总体而言，本研究结果为继续研究和优化这些天然化合物作为抗癌药物开发潜在候选物提供了坚实的初步基础。