乳腺肿瘤中具有适应特征的NKG2C+ NK细胞的表征与离体功能特性研究

《Frontiers in Immunology》：Characterization and ex vivo functional properties of NKG2C+ NK cells with adaptive features in breast tumors

　　

引言： 适应性自然杀伤细胞（Adaptive Natural Killer cells）是NK细胞的一个特殊亚群，具有增强的抗体依赖性效应功能，使其成为癌症免疫治疗中颇具吸引力的候选细胞。尽管循环中的适应性NK细胞已显示出强大的抗肿瘤活性，但其在乳腺肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）中的存在及功能状态在很大程度上仍属未知。 方法： 本研究调查了未经治疗的乳腺癌中具有适应特征的NKG2C+ NK细胞（aNK）的浸润情况、表型、功能特性及临床相关性。利用配对外周血、肿瘤及邻近非肿瘤乳腺组织样本，结合功能实验和来自癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）的转录组分析，研究人员对肿瘤浸润性aNK细胞进行了表征，并评估了其与临床结局的关联。 结果： aNK细胞存在于乳腺肿瘤中，同时保留其表型和增强的效应功能。肿瘤浸润性aNK细胞保持了稳健的抗体依赖性脱颗粒和IFN-γ产生能力。利用外周血来源aNK细胞的补充研究进一步证明了其促进树突状细胞成熟的优越能力，支持其免疫调节潜力。此外，研究人员分析了TCGA乳腺癌样本中适应性NK相关转录特征，发现较高的特征评分与更长的无进展间期及富含特定CD8+ T细胞群体的免疫微环境相关。 讨论： 这些发现表明，aNK细胞对抑制性乳腺TME具有功能韧性，在肿瘤浸润后仍能维持部分特化功能和免疫调节特性。其持续存在及与良好临床结局的关联，为进一步研究其在抗体类免疫治疗中的潜在作用以及作为乳腺癌（BC）治疗策略的可能靶点提供了依据。

论文解读

一、研究背景与研究目的

自然杀伤细胞（Natural Killer cells, NK cells）是抗肿瘤免疫的关键介质，不仅直接杀伤转化细胞，还通过细胞因子产生及与树突状细胞（dendritic cells, DCs）、巨噬细胞和T淋巴细胞的相互作用来调节固有和适应性免疫应答。然而，肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）通过多种机制（包括抑制性信号的长期暴露、代谢应激和抑制性细胞因子）促进NK细胞功能障碍，导致肿瘤浸润性NK细胞常表现为细胞毒性受损、细胞因子产生减少和受体表达改变。尽管这些缺陷已在整体NK细胞群体中得到广泛记录，但关于单个NK细胞亚群如何响应TME的差异知之甚少。

适应性NK细胞是主要在人巨细胞病毒（human cytomegalovirus, HCMV）感染后出现的高度特化NK细胞亚群。与传统NK细胞（conventional NK cells, cNK）不同，适应性NK细胞经历稳定的转录和表观遗传重编程，获得记忆样特征和增强的寿命。表型上，适应性NK细胞以NKG2C和CD57表达以及Fc?RIγ、NKG2A和PLZF低表达为特征，并具有增强的抗体依赖性细胞毒性（antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC）和IgG1抗体依赖性激活后炎症细胞因子产生增加的能力。

乳腺癌（breast cancer, BC）是研究适应性NK细胞生物学的相关临床场景。曲妥珠单抗（trastuzumab, TRZ）等抗体显著改善了HER2阳性患者的预后，其部分临床疗效依赖于NK细胞介导的ADCC。研究人员此前已证明适应性NK细胞存在于BC患者外周血中，保留其特征性表型，并较cNK细胞对曲妥珠单抗包被的HER2阳性肿瘤细胞表现出更优的应答。然而，适应性NK细胞进入肿瘤微环境后是否维持这些特化功能仍属未知。本研究旨在利用配对的外周血、肿瘤和邻近非肿瘤乳腺组织（non-tumoral breast tissue, NTB）样本，结合功能分析和转录组分析，系统探究具有适应特征的NKG2C⁺ NK细胞（aNK）在浸润人乳腺肿瘤后是否保留其特化的表型和功能。

二、主要技术方法

研究人员从51例HCMV血清阳性且未经系统治疗的乳腺癌患者中前瞻性收集外周血、原发乳腺肿瘤组织和配对邻近非肿瘤乳腺组织样本，所有患者外周血NK细胞中NKG2C⁺比例≥15%。主要技术方法包括：密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）；肿瘤组织经机械和酶解离获得单细胞悬液；多参数流式细胞术分析NK细胞亚群表型和功能；荧光激活细胞分选（fluorescence-activated cell sorting, FACS）分选aNK和cNK亚群；PMA/离子霉素刺激和抗CD16抗体（3G8）包被板刺激评估脱颗粒和细胞因子产生；单核细胞来源树突状细胞与NK细胞亚群及曲妥珠单抗调理的BT-474肿瘤细胞共培养体系评估DC成熟和NK细胞活化；利用TCGA乳腺癌队列和GEPIA3平台进行aNK相关基因特征的生存分析和相关性分析。

三、研究结果

3.1 具有适应特征的NKG2C⁺ NK细胞浸润人乳腺肿瘤并保留其标志性特征

流式细胞术分析显示，肿瘤中NK细胞占淋巴细胞的比例显著低于外周血和NTB，而CD56^bright NK细胞亚群在肿瘤中呈富集趋势。在全部51例HCMV血清阳性患者中，aNK细胞在外周血、肿瘤和NTB中的频率 remarkably 相似，无显著差异。肿瘤浸润性aNK细胞在Fc?RIγ表达上存在一定变异性，但NKG2A表达保持特征性低水平，尽管肿瘤浸润性NK细胞整体NKG2A表达增加，表明TME选择性调节部分表型特征但并未完全消除aNK细胞程序。

3.2 适应性NK细胞相关基因特征与BC良好临床结局相关

利用TCGA乳腺癌队列（n=1070）和GEPIA3平台，以15基因aNK特征（GZMH、KLRG1、S1PR5、FCRL6、CD8A、KLRK1、KLRC4、TTC16、FGFBP2、FNDC9、NKG7、KIR2DL3、KLRC3、PTGDR、KLRC2）作为肿瘤内浸润的替代指标，Kaplan-Meier分析显示高aNK特征评分患者的无进展间期（progression-free interval, PFI）和总生存期（overall survival, OS）均显著长于低评分患者（PFI：HR=0.59，p=0.00194；OS：HR=0.60，p=0.00223）。但OS两组中位数仅相差约一个月，可能不具有生物学意义。

3.3 肿瘤浸润性aNK细胞保留适应性相关表型特征

CD16表达在aNK细胞中低于cNK细胞，且两种亚群在肿瘤浸润后均较循环对应细胞降低约56%。NKp46表达呈现类似模式。TIGIT表达在肿瘤浸润中下降，而PD-1在aNK细胞中呈增加趋势。尽管TME诱导适应性NK细胞和传统NK细胞发生选择性表型重塑，aNK细胞仍保留区分该特化谱系的关键适应性相关表型特征。

3.4 肿瘤浸润aNK细胞保留离体优越效应功能

经PMA和离子omycin刺激后，aNK细胞较cNK细胞表现出更高的IFN-γ产生能力，肿瘤浸润性aNK细胞的IFN-γ产生水平与循环aNK细胞相当；但两种亚群在脱颗粒方面无显著差异。经板结合抗CD16激动性抗体（3G8）刺激后，尽管CD16表达部分下调，aNK细胞仍较cNK细胞表现出显著更高的IFN-γ产生和增强的脱颗粒能力。肿瘤来源NK细胞整体脱颗粒较外周血降低，但aNK细胞在CD16交联后始终优于cNK细胞。

3.5 aNK细胞较传统NK细胞更高效促进DC成熟

利用健康HCMV血清阳性供体外周血建立自体共培养体系，将未成熟单核细胞来源DC与FACS分选的aNK或cNK亚群在存在或不存在曲妥珠单抗调理的BT-474细胞条件下共培养。结果显示，虽然两种亚群均能增加CD80表达，但仅aNK细胞在曲妥珠单抗存在下显著增强CD83和CD86表达，且aNK细胞诱导的CD83表达显著高于cNK细胞。在NK细胞活化方面，DC的存在优先增强cNK细胞的CD25表达，而CD69和HLA-II在两种亚群中共培养后均上调。

3.6 aNK细胞浸润与表达免疫检查点受体的CD8⁺ T细胞相关

乳腺肿瘤中CD8⁺ T淋巴细胞比例高于外周血，且PD-1或TIGIT表达增加。CD8⁺PD-1⁺TIGIT⁺ T细胞比例与aNK细胞比例呈正相关。TCGA转录组分析进一步证实aNK细胞特征与CD8⁺ T细胞耗竭相关特征（HAVCR2、TIGIT、LAG3、PDCD1、CXCL13、LAYN）之间存在显著正相关（r=0.73，p=1.42e-183）。

四、讨论与结论

本研究表明aNK细胞能够浸润人乳腺肿瘤，同时保留部分将该亚群与cNK细胞区分开来的表型和功能特征。aNK细胞在肿瘤浸润后仍保持增强的CD16依赖性效应功能和免疫调节活性，其存在与良好临床结局和免疫活跃的TME相关。尽管肿瘤微环境诱导aNK和cNK细胞发生共享的表型改变（包括CD16和NKp46表达降低、NKG2A表达增加），但这些变化并未消除aNK细胞的适应性表型特征，提示环境线索诱导表型适应但并未完全覆盖其分化状态。

aNK细胞在CD16交联后维持优越的功能应答，尽管受体表达在TME内降低，这种功能韧性在抗体治疗肿瘤中可能构成重要优势。aNK细胞增强的DC成熟促进能力提示其可能不仅通过直接肿瘤杀伤，还通过促进生产性T细胞应答来参与抗肿瘤免疫。aNK细胞浸润与CD8⁺PD-1⁺TIGIT⁺ T细胞及耗竭相关基因特征的关联，支持aNK细胞与肿瘤浸润T淋巴细胞之间存在协调的免疫程序，但尚需功能研究确定潜在机制。

本研究的主要局限性包括：队列以管腔型乳腺癌为主，可能无法全面反映其他BC亚型中aNK细胞的生物学特性；DC成熟实验使用健康供体外周血来源细胞而非患者肿瘤来源DC；未进行多变量Cox比例风险分析以确定aNK特征与生存关联是否独立于既定的预后因素。

总体而言，本研究将适应性NK细胞鉴定为一种功能韧性的NK细胞亚群，在乳腺TME中持续存在并保留增强的效应和免疫调节功能，其存在与良好临床结局和免疫活跃的TME相关。适应性NK细胞可能不仅作为效应细胞，还通过整合抗体依赖性激活与下游适应性免疫应答的协调，充当抗肿瘤免疫的放大器。这些发现为未来旨在选择性扩增或治疗性利用该细胞群体以增强抗体类癌症免疫治疗的策略提供了概念框架。