冷冻保藏对熟制虾中亚硫酸盐定量检测的影响：一项官方监管验证研究

《Frontiers in Food Science and Technology》：Sample preservation by freezing: impact on sulfite quantification in cooked shrimp

　　

亚硫酸盐（sulfites）被广泛用于虾类加工中以预防黑变病（melanosis），然而冷冻对样品保藏期间亚硫酸盐稳定性的影响在监管监测领域仍未得到探究。本研究评估了?18 °C冷冻保藏是否显著影响熟制虾中亚硫酸盐的定量检测，旨在验证冷冻样品能否作为官方控制工作流程中冷藏样品的可靠替代方案。研究人员于2024年1月至7月期间从葡萄牙商业场所采集了31对配对熟制虾样品，并在分析前分别进行冷藏（4 °C）或冷冻（?18 °C）处理。每种保藏条件下均进行两次分析测定，其算术平均值用于统计分析。冷藏样品中亚硫酸盐水平范围为47至438 mg/kg（平均值：121.68 ± 74.51 mg/kg），冷冻样品中范围为29至350 mg/kg（平均值：131.68 ± 66.51 mg/kg）。两种保藏条件之间未发现统计学显著差异（配对t检验，p = 0.198）。冷冻保藏时长（范围为3至64天）与亚硫酸盐含量（r = ?0.107，p = 0.566）或与冷冻和冷藏结果之间的样品内差异（r = 0.07，p = 0.71）均无显著关联。配对样品之间观察到的合规状态变化应谨慎解读，因为分析不确定性、子采样变异性和亚硫酸盐异质性分布均可能影响结果。在所评估的具体条件下——主要为商业凡纳滨对虾（Penaeus vannamei）、约?18 °C保藏3至64天以及受控解冻——研究结果未提供冷冻系统性影响亚硫酸盐定量检测的证据，但不应在未经进一步验证的情况下推广至其他物种、地区或冷冻/解冻方案。

冷冻保藏对熟制虾亚硫酸盐定量检测影响的研究解读

一、研究背景与意义

甲壳类动物是全球重要的水产食品，其中虾类是最为广泛消费和贸易的海产品之一。熟制虾因其便捷性和风味而具有重要的市场价值，但其高度易腐，黑变病是限制其货架期和适销性的主要因素之一。黑变病是由多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）催化的酚类化合物酶促氧化过程，虽不危害消费者健康，但严重损害产品外观和商业价值。为延缓这一劣变过程，亚硫酸盐作为抗氧化剂和抗菌剂被广泛应用于虾类加工中，通过释放二氧化硫（SO₂）抑制酶活性并抑制微生物生长。

在欧盟，亚硫酸盐作为食品添加剂的使用受到严格监管。第1333/2008号法规（EC）及其修正案，包括第1129/2011号委员会法规（EU），规定了甲壳类动物中亚硫酸盐（以SO₂计）的最高限量。对于熟制甲壳类动物，根据规格大小不同，最高限量分别为135、180和270 mg SO₂/kg。葡萄牙经济与食品安全管理局（ASAE）负责监督这些法规的合规性，其官方食品安实验室（LSA）承担亚硫酸盐分析任务。然而，样品从采集地运输至集中实验室的过程中，温度波动、空气暴露和水分凝结等因素可能加速亚硫酸盐降解、促进挥发或导致浸出，从而造成检测结果低估，影响监管监测的准确性。

冷冻是延长熟制虾货架期的常规方法，但其对分析用样品保藏期间亚硫酸盐浓度的影响此前尚未得到研究。本研究正是针对这一实际缺口，评估在集中化官方控制实验室的具体条件下，冷冻能否作为熟制虾亚硫酸盐分析的样品保藏程序。

二、研究设计与方法概述

研究人员在2024年1月至7月期间，通过ASAE的常规官方控制活动采集了35份冷藏熟制带壳虾样品，最终纳入31份符合条件的配对样品，全部属于凡纳滨对虾（Penaeus vannamei）物种，规格不超过80只/千克。样品主要采集自葡萄牙里斯本大都会区（n = 29）和莱里亚市（n = 2）。每份样品到达实验室后被分为两份子样品：一份在约4 °C下冷藏并立即分析作为对照条件，另一份在?18 °C下冷冻保藏3至64天后分析作为实验条件。冷冻子样品在分析前一天下午转移至冰箱中缓慢解冻。亚硫酸盐定量采用基于优化Monier-Williams方法的LSA内部程序（Intern Method Number 18），该方法定量限（LOQ）为10 mg/kg，扩展不确定度（K = 2）为17%。每种保藏条件进行两次分析测定，取算术平均值用于统计分析。统计学分析采用Shapiro–Wilk检验评估配对差异的正态性，配对t检验比较两种保藏条件间的差异，Pearson相关系数评估冷冻保藏时长与亚硫酸盐含量及样品内差异的关系。

三、研究结果

亚硫酸盐含量概况：冷藏熟制虾样品中亚硫酸盐含量范围为47至438 mg/kg，平均值121.68 mg/kg，中位数113 mg/kg，标准差74.51 mg/kg。冷冻样品中范围为29至350 mg/kg，平均值131.68 mg/kg，中位数108 mg/kg，标准差66.51 mg/kg。多数配对样品间亚硫酸盐浓度基本一致，但S 1、S 7、S 8和S 11等若干配对表现出较大差异，且多数情况下冷冻样品中观察到较高浓度。

配对t检验结果：Shapiro–Wilk检验结果不显著（p = 0.797），Q-Q图未显示明显偏离正态性，支持使用参数检验。配对t检验结果不显著（p = 0.198），表明在测试条件下，冷冻熟制虾样品的亚硫酸盐含量与冷藏样品无显著差异。

冷冻时长相关性分析：冷冻保藏时长（3至64天，平均31天）与冷冻样品亚硫酸盐含量之间的Pearson相关系数为?0.107（p = 0.566），表明两者之间仅存在非常弱的负线性关系且不显著。冷冻保藏时长与Δ亚硫酸盐（冷冻值减冷藏值）之间的相关系数为0.07（p = 0.71），配对差异范围为?88至+112 mg/kg，正负值在全部保藏时长范围内均有出现，表明差异的大小和方向与冷冻保藏时长无系统性关联。

合规状态评估：对照熟制甲壳类动物（对虾科，规格不超过80只/千克）135 mg SO₂/kg的监管限量，冷藏样品中11/31份（35.5%）不合规，冷冻样品中14/31份（45.1%）不合规。五份样品（S 4、S 8、S 15、S 16和S 30）从冷藏状态合规转变为冷冻后不合规，两份样品（S 20和S 27）在冷冻后变为合规。

四、讨论与结论

讨论部分指出，这是首次从零售渠道获取熟制虾样品研究冷冻对亚硫酸盐含量影响的研究。以往关于冷冻海产品中亚硫酸盐稳定性的研究结果不一，常强调分析物本身的固有变异性。合规状态的变化应谨慎解读，因为分析程序17%的不确定度意味着接近法定限值的样品，其合规判定可能受方法统计变异性的影响而非亚硫酸盐含量的真实变化。亚硫酸盐通常通过浸泡偏亚硫酸盐溶液施加，导致组织内不均匀渗透和浓度梯度，即使同一均质材料的子样品也可能产生不同结果。手动滴定步骤也易受操作者因素影响。

研究结果未提供冷冻保藏时长与亚硫酸盐浓度变化相关的证据。配对比较无显著差异，样品内变化与保藏时长无显著相关，表明在3至64天的保藏区间内，更长的保藏时间并未与亚硫酸盐浓度的系统性增减相关联。然而，相对较小的样本量和非实验性的保藏时长分布限制了对小效应或非线性关系的排除能力。观察到的配对间显著变异性不太可能仅归因于保藏时长，可能涉及亚硫酸盐在虾组织内的异质性分布、初始浓度差异、子采样变异性和方法分析不确定性等因素。缓慢解冻过程可能减少与快速解冻相关的亚硫酸盐损失。

该研究结果对监管实践具有重要意义。冷冻保藏不损害亚硫酸盐定量检测的发现，支持制定稳健的采样方案，确保合规评估所用分析结果的完整性。对于需要长距离运输样品至集中实验室的官方控制系统，这一发现提供了实用且经济高效的解决方案。准确的亚硫酸盐定量对消费者保护和全球虾市场的公平贸易实践均有重要影响。

研究局限性包括：采样地理集中于里斯本大都会区；研究主要针对凡纳滨对虾（Penaeus vannamei）；31对样本量可能不足以检测较小差异；未探索?18 °C范围内温度变化或替代冷冻/解冻方法的影响；亚硫酸盐在虾组织内均匀分布的固有困难。

结论部分指出，在所评估的条件下，包括约?18 °C冷冻保藏3至64天及受控解冻，研究未发现统计学证据表明保藏时长系统性影响亚硫酸盐浓度。保藏条件间无显著差异与冷冻保藏时长和样品内亚硫酸盐含量变化缺乏相关性相结合，支持观察到的样品间变异性并非主要由冷冻保藏天数驱动的解释。这些发现支持在监管分析背景下使用冷冻保藏，同时承认在所研究范围之外无法完全排除保藏时长的小效应或非线性效应。