配对粪便与血清代谢组学揭示心血管-肾脏-代谢综合征中肠道与循环代谢的关联

《Frontiers in Endocrinology》：Paired metabolomics identify associations between fecal and serum metabolites in cardiovascular-kidney-metabolic syndrome

　　

背景：心血管-肾脏-代谢（cardiovascular-kidney-metabolic，CKM）综合征中粪便代谢改变是否与循环代谢变化相关仍不清楚。研究人员比较了不同CKM分期之间的血清和粪便代谢物，并探究了粪便-血清关联。 方法：44名受试者参与了这项横断面研究，包括19名CKM 1–2期受试者和25名CKM 3–4期受试者。所有受试者均接受了非靶向血清和粪便代谢组学以及粪便微生物组分析。35名受试者进行了探索性血清蛋白质组学分析。根据组间差异、注释置信度和冗余度筛选候选代谢物。计算了配对代谢物的CKM校正偏Spearman相关性。Bootstrap和留一受试者排除分析评估了稳定性。还检验了血清-粪便KEGG通路评分和临床关联。 结果：血清分析鉴定出470个已注释的非外源性特征。不同特征涉及脂质相关、有机酸和类固醇相关代谢物。粪便分析经Benjamini-Hochberg（BH）校正后鉴定出6个特征。17种粪便和48种血清代谢物的配对分析确定了8个探索性关联。血清尿苷与粪便1-棕榈酰溶血磷脂酸、Asp Ala Phe和PE（16:0/0:0）相关。CKM分组校正后，血清和粪便嘧啶代谢评分呈正相关（偏rho = 0.429，P = 0.0041，BH-FDR = 0.0246）。筛选出的代谢物主要与肾功能指标相关。粪便微生物组在3–4期表现出更大的属水平离散度。蛋白质组学分析鉴定出221个差异蛋白，富集于补体和凝血、炎症及脂质相关通路。 结论：配对血清和粪便代谢组学在CKM综合征中鉴定出血清和粪便嘧啶代谢评分之间的正相关，尿苷作为探索性候选代谢物与多种粪便代谢物相关。

论文解读：配对粪便与血清代谢组学揭示心血管-肾脏-代谢综合征中的跨系统代谢关联

一、研究背景与科学问题

心血管-肾脏-代谢（cardiovascular-kidney-metabolic，CKM）综合征被定义为代谢、肾脏和心血管系统之间病理生理相互作用所致的系统性疾患。美国心脏协会（American Heart Association，AHA）依据 adiposity、代谢危险因素、慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）和心血管疾病的存在及严重程度，将CKM分为0–4期。其中0–2期代表尚未出现明确心血管疾病的状态，而3–4期则以亚临床或临床心血管疾病为特征。因此，区分0–2期与3–4期的关键在于代谢功能障碍是否已造成心血管损伤。阐明两期之间的代谢差异，有助于理解CKM综合征中心血管受累的病理机制及潜在生物标志物。

现有证据表明，CKM相关的功能障碍由复杂的炎症和代谢组学失调驱动，尤其在脂质、氨基酸和胆汁酸通路中表现突出。然而，大多数CKM代谢组学研究仅分析了循环代谢物或蛋白质。鉴于CKM代谢扰动的系统性复杂性，单一系统的组学不足以全面刻画整体代谢图景，整合性多组学分析十分必要。肠道是参与代谢调节的另一重要系统，肠道微生物代谢参与短链脂肪酸、胆汁酸、吲哚衍生物和三甲胺相关代谢物的产生或转化，这些代谢物与代谢、肾脏和心血管功能障碍相关。但CKM综合征中肠道代谢的研究仍然有限。在CKD和心血管疾病中已有研究整合粪便和循环代谢组学数据，揭示了肠道与全身代谢特征之间的关联。然而，CKM综合征中粪便代谢改变是否与循环代谢变化相关仍不清楚。因此，本研究旨在通过配对分析粪便和血清代谢组学，确定肠道与全身代谢之间的关联。

二、研究设计与主要结论

研究人员在首都医科大学宣武医院开展了一项横断面研究，于2021年1月至2022年12月纳入44名受试者，其中19名为CKM 1–2期，25名为CKM 3–4期。所有受试者均接受了非靶向血清和粪便代谢组学及粪便16S rRNA测序分析，35名受试者进行了探索性血清蛋白质组学分析。研究首先分别分析了两个CKM组之间的血清和粪便代谢差异，随后整合配对粪便和血清代谢组学数据以识别与循环代谢特征相关的粪便代谢物，并进一步检验筛选代谢物与CKM分期及临床指标的关系。

研究得出以下主要结论：CKM 3–4期在血清代谢物方面比粪便代谢物表现出更广泛的差异；配对分析基于效应量和重采样稳定性筛选出8个探索性关联，其中血清尿苷在3个关联中重复出现；在KEGG通路水平上，血清和粪便嘧啶代谢评分经BH校正后呈正相关。嘧啶代谢被确定为配对粪便-血清代谢物关联中最突出的特征。

三、主要关键技术方法

本研究采用多项关键技术方法。研究队列来自首都医科大学宣武医院，为横断面设计。血清和粪便样本均采用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱（UHPLC-Q Exactive HF-X）系统进行非靶向代谢组学分析，数据经Progenesis QI处理，代谢物通过与HMDB、METLIN及Majorbio内部数据库比对进行推定注释。粪便微生物组分析采用16S rRNA基因V3-V4区扩增子测序，基于DADA2进行扩增子序列变异推断，并利用PICRUSt2预测微生物功能潜能。探索性血清蛋白质组学采用Orbitrap Astral质谱仪以数据非依赖采集模式进行。统计分析包括Mann-Whitney U检验、Cliff's delta效应量、偏Spearman相关分析、Bootstrap重采样和留一受试者排除分析，以及Benjamini-Hochberg（BH）多重检验校正。

四、研究结果

4.1 研究人群特征

44名受试者中，CKM 3–4期受试者表现出更高的收缩压和舒张压、更高的血清肌酐和血尿素氮，以及更低的估算肾小球滤过率（estimated glomerular filtration rate，eGFR）、血红蛋白、白蛋白和血钙。CKD在CKM 3–4期中的患病率为96.0%，显著高于1–2期的21.1%。糖尿病和高血压在3–4期中更为常见。两组在BMI、血糖、总胆固醇、甘油三酯和LDL胆固醇方面无显著差异。

4.2 血清代谢组学鉴定CKM 1–2期与3–4期之间的代谢差异

经质量控制后保留8294个血清特征。差异分析鉴定出589个已注释的非外源性特征，其中324个在CKM 3–4期中升高，265个降低。经BH校正后470个特征仍显著。脂质和脂质样分子是最具代表性的HMDB超类，共113个特征，其次是有机酸及其衍生物（90个）、有机杂环化合物（58个）、有机氧化合物（40个）和苯类化合物（34个）。大多数脂质和脂质样特征在CKM 3–4期中降低，而大多数有机酸及其衍生物、有机杂环化合物和有机氧化合物则升高。假尿苷、脱氧核糖、谷氨酰胺和羟脯氨酸在3–4期中更丰富，而色氨酸、肉碱、尿苷及多种类固醇和胆汁酸相关代谢物在3–4期中普遍降低。

4.3 粪便代谢组学鉴定CKM 1–2期与3–4期之间的代谢差异

粪便代谢组学鉴定出12869个特征，经质量控制后保留11837个。差异分析鉴定出498个已注释的非外源性特征，其中339个在CKM 3–4期中降低，159个升高。有机酸及其衍生物构成最大的超类。苹果酸、L-多巴、γ-谷氨酰丙氨酸和N-羟基-L-色氨酸在3–4期中降低，而葫芦巴碱、1-甲基腺嘌呤、赖氨酰缬氨酸、棉皮素和神经节苷脂GM2升高。经BH校正后仅6个特征保持显著，其中5个缺乏代谢物注释，仅葫芦巴碱为已注释特征且在3–4期中升高。

4.4 配对粪便和血清代谢组学鉴定相关代谢物

基于差异分析，最终筛选出17种粪便和48种血清代谢物进行816对配对检验。经CKM分组校正后计算偏Spearman相关，所有816个相关均未在BH校正后保持显著（最小BH-FDR = 0.465）。8个粪便-血清配对满足绝对偏rho ≥ 0.40且P < 0.005的组合探索性候选筛选标准，Bootstrap 95%置信区间排除零且留一分析无方向反转。其中最大的偏相关为粪便1-棕榈酰溶血磷脂酸与血清尿苷（偏rho = 0.479，P = 0.0012）。血清尿苷与粪便1-棕榈酰溶血磷脂酸、Asp Ala Phe和PE（16:0/0:0）相关，血清胞壁酸与粪便PE（16:0/0:0）和1-棕榈酰溶血磷脂酸相关。经年龄、性别和eGFR进一步调整后，关联仍保持正向。

在KEGG通路水平，24条通路满足化合物覆盖标准。其中血清和粪便嘧啶代谢评分在CKM分组校正后呈正相关（偏rho = 0.429，P = 0.0041，BH-FDR = 0.0246），经年龄、性别和eGFR进一步调整后仍保持正向。咖啡因代谢也显示正向血清-粪便关联，但被认为与饮食或药物相关。

4.5 配对粪便-血清代谢物特征的临床关联

8个探索性关联涉及的11种代谢物特征与12项临床指标进行了相关性分析。血清L-肉碱与eGFR呈正相关（rho = 0.752），与血清肌酐（rho = -0.746）和血尿素氮（rho = -0.724）呈负相关。血清4-甲基儿茶酚与血尿素氮呈正相关（rho = 0.609）。CKM分组校正后，4个关联在BH校正后仍显著，均集中于肾功能指标。敏感性分析中，8个粪便-血清代谢物关联在调整年龄、性别、eGFR、糖尿病史、BMI、甘油三酯和LDL胆固醇后仍为正向。

4.6 CKM 3–4期粪便微生物组个体间变异更大

Shannon和Simpson多样性指数在两组间无显著差异。Bray-Curtis主坐标分析显示两组间无显著组成差异（PERMANOVA，R2 = 0.022，P = 0.506）。但PERMDISP分析显示CKM 3–4期的属水平微生物组成多变量离散度显著大于1–2期（平均Bray-Curtis距离至组质心，0.513 vs 0.436，P = 0.011），表明3–4期存在更大的组成异质性。91个属中12个显示组间差异，但均未在BH校正后保持显著。546个属-代谢物配对中77个P < 0.05，但无一在BH校正后保持显著。PICRUSt2功能预测未鉴定出与实测代谢物的显著关联。

4.7 血清蛋白质组学为配对代谢物关联提供蛋白水平背景

35名受试者的嵌套亚队列中，6030个蛋白纳入差异分析，鉴定出221个BH-FDR < 0.05的差异蛋白，其中81个在CKM 3–4期中升高，140个降低。KEGG过表达分析鉴定出4条富集通路，包括补体和凝血级联（19个蛋白）、致心律失常性右心室心肌病（8个）、IL-17信号（6个）和花生四烯酸代谢（3个）。CHI3L1和PEBP4在CKM 3–4期中丰度较高。CHI3L1与血清胞壁酸的CKM校正相关不显著（偏rho = -0.289，P = 0.098），PEBP4与粪便PE（16:0/0:0）的关联亦不显著（偏rho = 0.038，P = 0.831）。蛋白-代谢物交叉组学分析未鉴定出FDR显著的关联。

五、讨论与结论

研究讨论指出，CKM 3–4期血清差异涉及多种化学类别，脂质相关特征的普遍性与CKM综合征整合肥胖、胰岛素抵抗、糖尿病、血脂异常、肾功能障碍和心血管疾病的临床构成一致。配对粪便和循环代谢组学在CKM中的证据仍然有限，本研究提示粪便和循环区室之间的代谢差异幅度和分布可能不同。嘧啶代谢是粪便-血清配对分析中最反复出现的循环通路，尿苷作为主要嘧啶核苷参与核苷酸合成和补救途径，其代谢与葡萄糖、脂质和氨基酸稳态相关。三个尿苷相关粪便代谢物代表肠道代谢的不同组分：1-棕榈酰溶血磷脂酸和PE（16:0/0:0）与甘油磷脂代谢和膜脂重塑相关，Asp Ala Phe反映肠道肽周转。嘧啶代谢通过CTP依赖途径与磷脂合成生化相关。临床关联分析中，筛选代谢物主要与肾功能指标相关，提示肾功能障碍对晚期CKM观察到的代谢模式有贡献。粪便微生物组未显示α多样性或整体组成的显著差异，但晚期CKM阶段微生物组成个体间异质性增加，提示相似代谢输出可能在不同微生物群落配置中发生。血清蛋白质组学鉴定出多个阶段相关蛋白差异，富集于免疫调节、凝血、脂质介质代谢和心血管结构蛋白通路。

研究结论：在这项CKM横断面队列中，3–4期比1–2期表现出更广泛的血清代谢差异，尤其涉及脂质相关、有机酸和类固醇相关代谢物。血清和粪便嘧啶代谢评分之间的正相关是主要的跨系统发现。血清尿苷是筛选出的粪便-血清关联中最反复出现的特征，值得进行靶向验证。